TRPC6調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞necroptosis在腎I-R中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　缺血再灌注損傷(I/R)是指組織器官在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流供應(yīng)以后，組織器官的損傷程度反而加重的現(xiàn)象。I/R普遍存在于臨床各科的工作實(shí)踐當(dāng)中，盡管曾經(jīng)有多種I/R的損傷學(xué)說被提出，例如:氧異常、鈣異常、PH異常等等。但是，I/R完整的發(fā)病機(jī)制迄今為止尚未能得到完全的闡明。腎臟由于其獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，是極易受缺血缺氧刺激的影響的靶器官，從而常常因?yàn)镮/R而發(fā)生急性腎損傷(Acutekidney injury，

2、AKI)。AKI是涉及多個(gè)臨床學(xué)科的常見急危重癥，不僅在外科領(lǐng)域，如腎移植、腎臟手術(shù)、腎梗阻積水、腎動(dòng)脈狹窄、栓塞性疾病等，而且在內(nèi)科領(lǐng)域，如各種腎小球疾病的急性期，I/R導(dǎo)致的AKI都是不可避免的腎臟損傷之一。AKI的典型病理改變是急性腎小管壞死，所以目前認(rèn)為腎小管上皮細(xì)胞的損傷在腎臟I/R的過程中居于關(guān)鍵地位。由于I/R發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚未能夠完全闡明，導(dǎo)致目前臨床上尚無有效的防治I/R的手段。所以，探討腎臟I/R的機(jī)制已成為臨床相關(guān)

3、領(lǐng)域中的重大課題，而努力尋找到一種能夠有效防治腎臟I/R的有效措施，將會(huì)產(chǎn)生重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
　　長(zhǎng)久以來的傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為:凋亡(apoptosis)是一種細(xì)胞自我調(diào)控的主動(dòng)病理生理過程;而壞死(necrosis)則被認(rèn)為是相對(duì)不可逆的細(xì)胞死亡過程，難以通過藥理學(xué)途徑的干預(yù)得到阻止或者說逆轉(zhuǎn)。然而，目前的研究發(fā)現(xiàn):在細(xì)胞壞死的大背景中，至少有相當(dāng)部分的細(xì)胞壞死可以像凋亡那樣，由特定的刺激信號(hào)啟動(dòng)，并且按照一定的信號(hào)傳導(dǎo)通路和執(zhí)

4、行程序發(fā)生，具有精密的調(diào)控機(jī)制，并被命名為“necroptosis”（程序性壞死，又被譯做壞死性凋亡）。necroptosis的發(fā)現(xiàn)和研究進(jìn)展使得臨床上對(duì)細(xì)胞壞死的過程進(jìn)行調(diào)控成為可能，那就有可能將對(duì)生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床相關(guān)疾病的治療產(chǎn)生重要的影響。necroptosis已被證實(shí)存在于腎臟I/R中，并且研究者們發(fā)現(xiàn)是necroptosis的特異性抑制劑necrostatin-1而不是apoptosis的關(guān)鍵酶Caspase的阻滯劑z

5、VAD能顯著改善腎臟I/R動(dòng)物模型的組織損害，這就提示我們:necroptosis在腎臟I/R中發(fā)揮了比apoptosis更為重要的作用，在I/R過程中阻斷necroptosis是防治腎臟I/R的新方向。necroptosis的發(fā)生受到脫乙酰酶sirtuin-2的調(diào)控，這是因?yàn)閟irtuin-2的脫乙酰化作用是necroptosis的關(guān)鍵信號(hào)分子受體相互作用蛋白1(receptor-interactingprotein1，RIP1)與受

6、體相互作用蛋白3(receptor-interacting protein3，RIP3)直接互作作用的必要條件。而sirtuin-2的酶活性取決于它的輔因子NAD+的水平。而我們知道，NAD+活性的降低與細(xì)胞能量的缺乏和氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，由此推斷necroptosis也是受代謝因素調(diào)控的。眾所周知，缺血缺氧和再灌注過程導(dǎo)致的代謝因素的變化在腎I/R的發(fā)生中扮演重要的角色:在腎臟缺血的急性期由于缺氧會(huì)發(fā)生NAD+水平的下降甚至耗竭，而再灌

7、注以后NAD+水平將會(huì)得到迅速地補(bǔ)充。這就或許可以解釋為何在缺血再灌注的過程中最初并沒有廣泛的細(xì)胞死亡，但在再灌注后卻轉(zhuǎn)而發(fā)生。我們推測(cè)這可能是因?yàn)?再灌注發(fā)生以后NAD+水平會(huì)獲得快速地補(bǔ)充，使得sirtuin-2的酶活性升高，RIP1與RIP3的相互作用得到加強(qiáng)，損傷信號(hào)加速傳遞，從而促進(jìn)了necroptosis的發(fā)生;同時(shí)，由于necroptosis總是伴發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，也將通過炎癥因子激發(fā)的“瀑布效應(yīng)”進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞的損傷。如

8、果能證實(shí)以上推斷，就將為我們打開了一扇機(jī)會(huì)之窗:通過在再灌注開始前阻斷細(xì)胞的necroptosis來阻止腎臟I/R。
　　傳統(tǒng)型瞬時(shí)性受體電位通道6(transient receptor potential cation channel，TRPC6)是屬于傳統(tǒng)型瞬時(shí)性受體電位通道(TRPC)家族的成員之一，是位于細(xì)胞膜上的非選擇性的陽離子通道。TRPC6激活后主要功能是介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，并通過受鈣離子調(diào)控的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)細(xì)胞外

9、-內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前的研究證明，TRPC6具有促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)育和生存的作用，且其表達(dá)與體內(nèi)代謝因素調(diào)控的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)氧化酶和活性氧(ROS)的活性有關(guān)，并且在腦缺血、視網(wǎng)膜以及肺的缺血再灌注損傷中也發(fā)揮了重要的作用。TRPC6在人腎小管上皮細(xì)胞上表達(dá)，我們?cè)谇捌诘念A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TRPC6在腎臟I/R模型中表達(dá)也是增加的，并能夠上調(diào)和sirtuin-2具有相同底物NAD+的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(P

10、oly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1)的水平。所以，根據(jù)目前的研究進(jìn)展和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在本研究中，我們從離子通道蛋白與腎臟I/R損傷的關(guān)系入手，擬探索TRPC6在腎臟I/R中調(diào)控necroptosis的作用及其機(jī)制，以便為腎臟I/R的防治提供新的思路和新的治療靶點(diǎn)。
　　材料和方法：
　　1、利用基因檢測(cè)芯片檢測(cè)Brown Norway(BN)大鼠、Sprague Dawley(SD)大鼠腎臟I

11、/R模型差異基因，利用NCBI GEO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行miRNA靶基因網(wǎng)絡(luò)分析、蛋白網(wǎng)絡(luò)模塊分析，篩選出差異基因并預(yù)測(cè)其可能的作用。
　　2、免疫熒光染色法測(cè)定TRPC6在HK-2細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　3、按照文獻(xiàn)方法，利用礦物油隔絕氧氣，利用增加了鈣、鎂的PBS孵育阻斷能量供應(yīng)來創(chuàng)建HK-2細(xì)胞體外缺血再灌注損傷模型。
　　4、利用RNAI技術(shù)篩選、擴(kuò)增TRPC6低表達(dá)的HK-2細(xì)胞。
　　5、利用AnnxinⅤ-

12、FITC/PI試劑盒，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HK-2細(xì)胞在體外缺血再灌注損傷過程中的壞死/凋亡比例。
　　6、利用western blot方法檢測(cè)HK-2細(xì)胞TRPC6、RIP1、PARP-1、sirtuin-2、AIF的蛋白表達(dá)變化情況。
　　7、利用切除左腎，動(dòng)脈夾夾閉右腎動(dòng)脈40min的方法建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型。
　　8、利用Olympus AU2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清血肌酐水平。

13、　　9、利用腎組織病理HE染色觀察缺血再灌注大鼠腎臟損傷的形態(tài)學(xué)變化，并進(jìn)行腎小管壞死半定量評(píng)分。
　　10、利用超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒進(jìn)行腎臟組織免疫組化染色，觀察RIP1、RIP3、TRPC6、CaMKII、PARP-1在腎臟組織的表達(dá)變化。
　　11、利用Western-blot檢測(cè)腎臟組織TRPC6、PARP-1、RIP1、sirtuin-2蛋白表達(dá)變化情況。
　　12、利用工具藥:OAG、SKF9636

14、5、KN-93研究TRPC6通道以及CaMKII在信號(hào)傳導(dǎo)中的作用。
　　主要結(jié)果：
　　1、篩選出了包括TRPC6在內(nèi)的23個(gè)共同表達(dá)差異表達(dá)基因，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，我們分別利用信息庫對(duì)上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因進(jìn)行了miRNA靶基因預(yù)測(cè)，并構(gòu)建了預(yù)測(cè)的網(wǎng)絡(luò)分析圖。
　　2、HK-2細(xì)胞表達(dá)TRPC6，并在細(xì)胞體外缺血再灌注損傷過程中表達(dá)明顯增加。
　　3、HK-2細(xì)胞體外缺血再灌注損傷模型中，細(xì)胞的死亡以壞

15、死為主，且能被necrostatin-1抑制，說明在這一病理過程中存在necroptosis。
　　4、采用RNAI下調(diào)TRPC6表達(dá)的HK-2細(xì)胞在體外缺血再灌注損傷模型中的細(xì)胞壞死率明顯升高。
　　5、TRPC6激動(dòng)劑OAG干預(yù)可以使HK-2細(xì)胞在體外缺血再灌注損傷模型中的細(xì)胞壞死率明顯下降，取得與necroptosis特異性抑制劑nec-1類似的效果;而TRPC6阻斷劑SKF96365和CaMKII抑制劑KN-93干預(yù)

16、，使得HK-2細(xì)胞在體外缺血再灌注損傷模型中的細(xì)胞壞死率明顯升高。
　　6、體外缺血再灌注損傷模型中，采用RNAI下調(diào)TRPC6表達(dá)的HK-2細(xì)胞的PARP-1的表達(dá)明顯下調(diào);sirtuin-2的表達(dá)未受TRPC6下調(diào)的影響;RIP1的表達(dá)在TRPC6下調(diào)后明顯升高。
　　7、體外缺血再灌注損傷模型中，OAG干預(yù)組的HK-2細(xì)胞的PARP-1表達(dá)升高，而SKF96365和KN-93組PARP-1表達(dá)下調(diào);RIP1的表達(dá)變化與

17、此相反:OAG組RIP1表達(dá)下調(diào)，而SKA96365和KN-93組PARP-1表達(dá)升高。
　　8、在腎臟缺血再灌注大鼠模型中，TRPC6主要在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)，腎小球也有表達(dá);再灌注后24、48h TRPC6的表達(dá)明顯增多，第5天TRPC6的表達(dá)開始減少; PARP-1、RIP1、sirtuin-2的蛋白表達(dá)與TRPC6有類似的變化趨勢(shì)。
　　9、在腎臟缺血再灌注大鼠模型中，采用OAG干預(yù)的大鼠，血肌酐水平明顯下降;而使用

18、SKF96365、KN-93干預(yù)的大鼠，血肌酐水平與缺血再灌注組相比明顯升高。
　　10、使用OAG干預(yù)后，缺血再灌注大鼠組織PARP-1表達(dá)升高、RIP1表達(dá)降低;相反，使用SKF96365、KN-93干預(yù)后，缺血再灌注大鼠組織PARP-1表達(dá)下降，RIP1表達(dá)升高。
　　結(jié)論：
　　1、利用基因檢測(cè)芯片檢測(cè)差異表達(dá)蛋白以及靶基因網(wǎng)絡(luò)分析、蛋白網(wǎng)絡(luò)模塊分析，發(fā)現(xiàn)TRPC6是缺血再灌注損傷的差異基因之一并預(yù)測(cè)其可能在調(diào)

19、控缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。
　　2、在HK-2細(xì)胞的體外缺血再灌注損傷模型中，TRPC6表達(dá)明顯增加，通過CaMKII上調(diào)PARP-1的表達(dá)，通過PARP-1與sirtuin-2的競(jìng)爭(zhēng)作用調(diào)控necroptosis;采用RNAI技術(shù)下調(diào)TRPC6表達(dá)的HK-2細(xì)胞在體外缺血再灌注損傷模型中壞死率明顯升高，PARP-1表達(dá)下降，sirtuin-2表達(dá)無明顯變化，而RIP1表達(dá)也明顯升高。
　　3、在大鼠腎臟缺血再灌注損傷