建立一種PCR-LDR-熔解曲線分析方法用于地中海貧血突變檢測(cè).pdf

1、背景與目的:
　　 地中海貧血(thalassemia，簡(jiǎn)稱:地貧)是一組全球最常見、對(duì)人類健康影響最大的常染色體單基因隱性遺傳病之一。發(fā)病原因是珠蛋白基因的缺陷導(dǎo)致血紅蛋白(hemoglobin，Hb)四聚體中的珠蛋白肽鏈有一種或幾種合成減少或缺乏（即不能合成），而引起血紅蛋白的組成成分比例失衡，進(jìn)而導(dǎo)致血紅蛋白不穩(wěn)定、紅細(xì)胞破壞，表現(xiàn)為臨床癥狀輕重不等的慢性進(jìn)行性溶血性貧血。地中海貧血分為α、β、δβ和δ等4種類型，其中以α

2、-和β-地中海貧血較為常見。地中海貧血的發(fā)生遍布人類生活的地方，亞洲、大洋洲、歐洲、非洲和美洲等五大洲都有地貧的發(fā)生，其中熱帶和亞熱帶的發(fā)生率較高。東南亞是地貧發(fā)生率最高的地區(qū)之一。我國長江以南的廣大地域?yàn)樵摬〉母甙l(fā)區(qū)，其中尤以廣西和廣東兩?。▍^(qū)）最為顯著。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國南方人群中α-地中海貧血基因攜帶率約為10％，β地中海貧血致病基因攜帶率為2.8％。
　　 α-地中海貧血(a-thalassemia，簡(jiǎn)稱:α-地貧)是由于α-珠

3、蛋白基因的缺失或者突變導(dǎo)致α-珠蛋白肽鏈合成受到抑制而引起的溶血性貧血，是世界上最常見且發(fā)病率最高的一種單基因遺傳。α-地貧分為缺失型α-地貧和非缺失型a-地貧兩大類。雖然α-地中海貧血主要是由于基因缺失而引起的;但非缺失型突變?cè)贖bH的基因缺陷中占較大比例。而且非缺失型HbH病人的大多都表現(xiàn)出更嚴(yán)重的α-鏈合成減少，Hb含量更低而HbH的量更高，因此臨床表現(xiàn)也更為嚴(yán)重，此類患者多數(shù)具有輸血依賴性;而后者臨床表現(xiàn)相對(duì)較輕，也極少需要依靠

4、常規(guī)輸血維持生命。此外非缺失型α-地貧與α-地貧1雙重雜合還可導(dǎo)致HbH胎兒水腫綜合癥。
　　 目前對(duì)α-地貧尚無理想的治療方法，應(yīng)用DNA分析技術(shù)通過大人群篩查和對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)夫婦采取早期產(chǎn)前診斷和選擇性終止妊娠以防重癥胎兒出生，是國際上公認(rèn)的首選辦法，有著重要的優(yōu)生學(xué)意義。
　　 隨著分子生物學(xué)的技術(shù)的發(fā)展，大量的新技術(shù)新方法應(yīng)用于地貧的突變檢測(cè)。DNA測(cè)序技術(shù)因具有極高的準(zhǔn)確性被譽(yù)為突變檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是該方法需要昂

5、貴的儀器設(shè)備、成本較高，而且實(shí)驗(yàn)操作步驟較多，所以不適合臨床和大規(guī)模篩查。除DNA測(cè)序技術(shù)外，還有許多方法應(yīng)用與地中海貧血的突變檢測(cè)。其中一類是根據(jù)DNA突變的發(fā)生引起DNA單鏈的構(gòu)象變化或影響DNA雙鏈的穩(wěn)定性的原理對(duì)突變進(jìn)行檢測(cè)，如單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-StrandConformationPolymorphism，SSCP)、變性梯度凝膠電泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE

6、)、溫度梯度凝膠電泳(TemperatureGradientGelElectrophoresis，TGGE)。但以上的方法均是基于凝膠電泳進(jìn)行分析，不利于臨床的應(yīng)用。高效液相色譜(DenaturedHighPerformanceLiquidChromatography，DHPLC)同樣是基于突變引起DNA雙鏈熱穩(wěn)定性改變的原理發(fā)展的一種快速，精確，自動(dòng)化的突變檢測(cè)方法，但該方法通量比較低，一次進(jìn)樣只能檢測(cè)一種突變，所以不適合用于大規(guī)模篩

7、查?；蛐酒?GeneChip)作為一種先進(jìn)的、大規(guī)模、高通量檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用于突變的檢測(cè);然而該技術(shù)成本較高，假陽性率高，目前仍沒有廣泛應(yīng)用到地中海貧血的臨床診斷。另外，同樣基于DNA雜交原理的突變檢測(cè)方法有寡核苷酸探針雜交法(Allele-SpecificOligonucleotideprobe，ASO)和反向點(diǎn)雜交法(ReverseDotBlot，RDB)，其中RDB法相比ASO法更簡(jiǎn)便易行，而且信號(hào)特異性強(qiáng)，技術(shù)要求低，儀器設(shè)備投

8、入小，更符合中國目前的國情，是目前我國應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。目前RDB技術(shù)整個(gè)雜交過程的操作步驟比較多，操作時(shí)間也相對(duì)較長，成為大規(guī)模推廣應(yīng)用的阻力。
　　 連接酶檢測(cè)反應(yīng)(LigaseDetectionReaction，LDR)是一種新興的突變檢測(cè)技術(shù)。其工作的原理是利用DNA連接酶具有極強(qiáng)的突變識(shí)別能力，上游探針和下游探針跟目標(biāo)雜交時(shí)，只有當(dāng)探針與目標(biāo)完全互補(bǔ)是才能被連接;如果在上游引物的3'端或下游引物的5'端發(fā)生堿基錯(cuò)配都會(huì)

9、使連接反應(yīng)不能進(jìn)行，從而不能形成連接產(chǎn)物。由于LDR反應(yīng)使用的是具有熱穩(wěn)定性的DNA連接酶，可以進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)，連接產(chǎn)物呈線性增長，具有一定的信號(hào)放大效果。LDR的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是多重性:由于連接反應(yīng)具有很強(qiáng)的特異性，所以允許同一個(gè)反應(yīng)中加入多組針對(duì)不同突變位點(diǎn)的探針，其探針之間的干擾非常小，能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)突變進(jìn)行檢測(cè)。目前，LDR技術(shù)結(jié)合PCR技術(shù)(PCR/LDR)廣泛應(yīng)用于突變研究和臨床的突變檢測(cè)。該方法結(jié)合了PCR技術(shù)的高靈敏性和LD

10、R技術(shù)的高特異性;首先通過PCR反應(yīng)對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過LDR反應(yīng)對(duì)突變進(jìn)行區(qū)分。
　　 在LDR引物上標(biāo)記熒光基團(tuán)，使LDR反應(yīng)的產(chǎn)物能夠使用熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行分析。目前常用的檢測(cè)方法有毛細(xì)管電泳法(CapillaryElectrophoresis，CE)和芯片法(ChipAssay)。其中，毛細(xì)管電泳分析是通過不同突變類型產(chǎn)生的連接產(chǎn)物片段長度的不同進(jìn)行突變區(qū)分的。但由于毛細(xì)管電泳法通量較低，而且一起設(shè)備昂貴，所以其應(yīng)

11、用沒有芯片法廣泛。芯片法具有高通量的優(yōu)勢(shì)，而且LDR技術(shù)結(jié)合芯片分析與傳統(tǒng)芯片結(jié)果比較:結(jié)果唯一確定，非此即彼;沒有假陽性假陰性結(jié)果;操作簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性強(qiáng)。但是，芯片分析的需要把連接產(chǎn)物與未連接的引物分離，洗脫步驟比較費(fèi)時(shí)，不利于快速檢測(cè)。
　　 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer，F(xiàn)RET)原理的探針用于LDR反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)可以免除對(duì)未連接引物的清除。只有當(dāng)連

12、接反應(yīng)發(fā)生，兩個(gè)熒光基團(tuán)靠近才能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)，而未連接的引物不能發(fā)出熒光信號(hào)，從而不需要進(jìn)行連接產(chǎn)物與引物分離。分子信標(biāo)(MolecularBeacon，MB)是其中一種基于基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理設(shè)計(jì)的分子探針。分子信標(biāo)由于具有高靈敏度和高特異性等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中。
　　 由于PCR/LDR分析方法提供了一種新的點(diǎn)突變檢測(cè)策略，本研究目的在于建立一種準(zhǔn)確性高，高靈敏，快速的基于P

13、CR/LDR法的點(diǎn)突變檢測(cè)方法，用于地中海貧血已知點(diǎn)突變的檢測(cè)。
　　 設(shè)計(jì)與方法:
　　 本方法的設(shè)計(jì)理念:本方法設(shè)計(jì)一種全新的信號(hào)轉(zhuǎn)換方式，利用分子信標(biāo)自身的熱穩(wěn)定性，利用一系列具有不同Tm值stem端得分子信標(biāo)作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器，把目標(biāo)的突變信號(hào)轉(zhuǎn)換為溫度信號(hào)，通過溶解曲線分析來對(duì)突變進(jìn)行分析。
　　 PCR/LDR/熔解曲線分析檢測(cè)突變的實(shí)驗(yàn)流程如下:第一步，對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生大量的擴(kuò)增子作為LD

14、R反應(yīng)的模板。第二步，進(jìn)行LDR反應(yīng)，當(dāng)突變存在時(shí)，上游引物和下游引物與模板完全互補(bǔ)，在TaqDNA連接酶的作用下連接在一起;由于TaqDNA連接酶具有耐熱性，可以進(jìn)行熱循環(huán)。第三步，連接產(chǎn)物在高溫淬火后形成分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)，由于熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)緊緊靠近，熒光被淬滅。第四步，進(jìn)行熔解曲線分析，隨著溫度升高，分子信標(biāo)打開熒光逐漸增強(qiáng)。第五步，通過軟件分析得出分子信標(biāo)的Tm值，通過不同的Tm值判斷突變的類型。
　　 本研究的方法如下:

15、1.實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?本研究采用α-地中海貧血的三種常見點(diǎn)突變(HbWS、HbQS、HbCS)作為模型構(gòu)建PCR/LDR熔解曲線分析方法。2.LDR引物的設(shè)計(jì):針對(duì)3個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)3對(duì)LDR引物，每一對(duì)引物包括上游引物和下游引物。上游引物的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)(HEX)而3'端為識(shí)別堿基（該序列于突變序列完全互補(bǔ)）;下游引物的3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)(BHQ1)，5'為磷酸化修飾。除了與目標(biāo)互補(bǔ)的序列外，上游引物的5'和下游引物的3'端為一段互補(bǔ)的stem

16、結(jié)構(gòu)。上下游引物組成的分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)用Zucker實(shí)驗(yàn)室的DNA折疊軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)。3.用人工合成的目標(biāo)進(jìn)行LDR/熔解曲線分析方法的構(gòu)建并評(píng)價(jià)TaqDNA連接酶的特異性。4.針對(duì)α2基因設(shè)計(jì)PCR引物并擴(kuò)增包含3種突變類型的片段;PCR產(chǎn)物用于單重和多重PCR/LDR/熔解曲線分析的建立和條件優(yōu)化，并對(duì)該方法的靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果與討論:
　　 用人工合成目標(biāo)作為模

17、板的模擬實(shí)驗(yàn)證明了該方法是可行的。當(dāng)用突變目標(biāo)作為模板時(shí)熔解曲線分析結(jié)果得出一個(gè)峰尖朝下的熔鏈峰;而用野生目標(biāo)作模板或沒有模板的情況下不出現(xiàn)熔鏈峰。TaqDNA連接酶具有很強(qiáng)的突變識(shí)別能力，特異性很高。TaqDNA連接酶能在不同的buffer下工作。針對(duì)3個(gè)突變位點(diǎn)的合成目標(biāo)分析結(jié)果得到的各位點(diǎn)分子信標(biāo)Tm值于預(yù)測(cè)的溫度有一定的差異，但屬于溫度平行增加，各實(shí)測(cè)溫度與預(yù)測(cè)溫度的差值(△Tm)接近。用PCR產(chǎn)物進(jìn)行單重和多重LDR/熔解曲線

18、分析得出的各分子信標(biāo)的Tm值與模擬實(shí)驗(yàn)的相符，由于buffer中離子濃度和pH值的不同，溫度有一定的偏差。多重反應(yīng)的結(jié)果說明該方法具有高通量檢測(cè)的潛力。靈敏度分析結(jié)果顯示，該方法可以檢測(cè)到100pg人類基因組DNA模板，具有較高的靈敏度。
　　 結(jié)論:
　　 本研究提出的PCR/LDR/熔解曲線分析方法是一種快速，準(zhǔn)確的點(diǎn)突變檢測(cè)技術(shù)?，F(xiàn)階段僅對(duì)3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行多重反應(yīng)，由于LDR反應(yīng)具有很好的多重反應(yīng)性，加上采用不同的熒光