通路抑制劑LY294002、PD98059對SDF-1介導(dǎo)的卵巢癌細胞增殖和侵襲能力的影響.pdf

1、背景與目的
　　基質(zhì)衍生因子-1（stromalcell-derivedfactorl，SDF-1）是由骨髓基質(zhì)細胞及其他相關(guān)的間皮細胞和上皮細胞分泌的一種趨化蛋白，系統(tǒng)命名為CXCL12。趨化因子受體4(chemokinereceptor4，CXCR4)是SDF-1的主要受體。SDF-1與CXCR4特異性結(jié)合后形成的SDF-1/CXCR4生物軸廣泛參與體內(nèi)多種病理生理過程，研究證實SDF-1/CXCR4與腫瘤的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移密

2、切相關(guān)。SDF-1與CXCR4的結(jié)構(gòu)和相互作用機制是發(fā)揮其病理、生理功能的基礎(chǔ)。盡管有報道稱SDF-1、CXCR4在卵巢癌組織及細胞中呈高表達，SDF-1可促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲、遷移能力，但關(guān)于SDF-1/CXCR4對卵巢癌增殖和侵襲能力影響的作用機制尚不清楚。信號通路的激活是癌發(fā)生的早期事件，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號途徑是細胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路;分裂原活化抑制劑/蛋白激酶(MEK/ERK)信號途徑是

3、重要的細胞外信號傳導(dǎo)通路。本實驗主要研究SDF-1對卵巢癌細胞的增殖、侵襲能力的促進作用是否能被MEK抑制劑PD98059、Akt抑制劑LY294002所阻斷，從而探討SDF-1/CXCR4生物軸與信號通路MEK/ERK及PI3K/AKT信號通路的關(guān)系。
　　方法
　　1.細胞培養(yǎng)卵巢癌細胞系SKOV3，應(yīng)用含12％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5％CO2、37℃、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育。
　　2.采

4、用細胞免疫化學(xué)檢測SDF-1作用不同時間以及不同作用濃度，卵巢癌細胞表達磷酸化AKT(P-AKT)和ERK(P-ERK)水平的變化;
　　3.采用四甲基亞唑藍(MTT)法檢測卵巢癌SKOV3細胞在100ng/mlSDF-1、10μg/mlCXCR4中和抗體、1μg/mlCXCR4抑制劑AMD3100、50μmol/LLY294002、50μmol/LPD98059作用下細胞增殖能力的變化。
　　4.采用Transwell細胞

5、侵襲實驗法檢測卵巢癌SKOV3細胞在100ng/mlSDF-1、10μg/mlCXCR4中和抗體、1μg/mlCXCR4抑制劑AMD3100、50μmol/LLY294002、50μmol/LPD98059作用下細胞侵襲能力的變化。
　　5.采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，定性資料采用等級資料秩和檢驗;定量資料以(x)±s表示，方差齊性檢驗，多組間的比較采用方差分析，多個樣本均數(shù)的兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.

6、05,以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1.磷酸化的ERK蛋白主要表達于SKOV3細胞的胞質(zhì)和胞核中，以胞核表達為主，磷酸化的Akt主要表達于卵巢癌細胞的胞質(zhì)中，鏡下可見棕黃色顆粒。根據(jù)陽性細胞數(shù)及細胞染色程度表示蛋白表達水平，隨著100ng/mlSDF-1作用時間的延長，棕黃色顆粒由淺至深，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P-ERK:x2=24.011,P=0.000;P-AKT:x2=16.408,P=0.003)

7、;30分鐘組與60分鐘組相互比較，細胞內(nèi)棕黃色顆粒的染色程度基本一致，無明顯差異(P-AKT:x2=4.835,P=0.089;P-ERK:x2=1.725,P=0.422)?？梢?00ng/mlSDF-1的最佳作用時間為30分鐘;當(dāng)作用時間為30分鐘時，隨SDF-1濃度的增加，PERK、P-Akt蛋白的染色程度也隨之加重，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P-ERK:x2=8.467，P-0.015;P-AKT:x2=8.345，P=0.015。<

8、br>　　2.與無血清對照相比，SDF-1組的吸光度值(OD492)明顯較高(d=-0.12378,P=0.007);但同時加入10μg/mlCXCR4中和抗體(d=0.12956,P=0.005)、1μg/mlCXCR4抑制劑AMD3100后(d=0.13900,P=0.003)，與SDF-1組相比，吸光度值(OD492)則無明顯升高;此外，在SDF-1中同時加入50μmol/LPD98059(d=0.11594,P=0.014)、5

9、0μmol/LLY294002(d=0.10978,P=0.025)后，與SDF-1組相比，吸光度值(OD492)亦無明顯升高。
　　3.與無血清對照相比，SDF-1組的遷移細胞數(shù)（平均70.2±9.22316個）明顯多于無血清對照組（平均23.1±1.64007個），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(d=-47.1,P=0.000);但同時加入10μg/mlCXCR4中和抗體（平均27.7±4.73873個）、1μg/mlCXCR4抑制劑AM

10、D3100（平均30.3±6.25478個）后，細胞穿透數(shù)目無明顯增多，與SDF-1組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;此外，同時加入50μmol/LPD98059（平均20.7±4.34741個）、50μmol/LLY294002（平均24.3±3.59166個）后，細胞穿透數(shù)目亦無明顯增多，與SDF-1組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論
　　SDF-1可促進卵巢癌細胞的增殖和侵襲能力，但這種作用可被MEK抑制劑PD98059、A