豬流行性腹瀉病毒引起細(xì)胞周期阻滯的研究.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrheavirus,PEDV)是一種對(duì)豬群具有強(qiáng)感染性的病毒,可引起豬群出現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐、厭食消瘦的癥狀,尤其對(duì)初生仔豬的發(fā)病率和致死率可高達(dá)90-100％。該病毒引起的豬流行性腹瀉病(PED)自1971年首次爆發(fā)以來,先后在比利時(shí)、捷克、中國(guó)、韓國(guó)、越南及美國(guó)等國(guó)家爆發(fā),2010年10月以后,由新的流行株所引起的PEDV開始在我國(guó)爆發(fā),給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。

2、>　　本研究通過對(duì)病毒增殖規(guī)律及其感染引起細(xì)胞周期阻滯的研究,分析PEDV的致病原因,以期為該病致病機(jī)理及疾病的防控提供理論支持。首先我們以本實(shí)驗(yàn)室PEDV分離株HLJ/2011的N基因?yàn)槟０?設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和探針,經(jīng)過對(duì)一系列反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了Taq Man-MGB熒光定量PCR方法,該方法特異性較強(qiáng),其敏感性可達(dá)0.1TCID50/0.1ml,可以作為豬流行性腹病毒感染診斷的特異性檢測(cè)方法,同時(shí)該方法又具有定量的特性,為下一

3、步測(cè)定病毒感染細(xì)胞后的增殖規(guī)律提供技術(shù)支持。其后,我們利用CPE觀察及IFA技術(shù)測(cè)定了PEDV在感染細(xì)胞后的增殖動(dòng)態(tài),證實(shí)PEDV分離株HLJ/2011感染VERO細(xì)胞后12-24h中病毒生長(zhǎng)曲線的斜率最大,表明此階段病毒增殖速率最快;同時(shí)我們利用流式細(xì)胞技術(shù)及Western Blot技術(shù)等確定PEDV增殖對(duì)VERO細(xì)胞周期的影響,結(jié)果表明PEDV感染后能夠引起VERO細(xì)胞在G1/G0期產(chǎn)生阻滯。為了進(jìn)一步解析PEDV所引起的細(xì)胞周期阻

4、滯現(xiàn)象與細(xì)胞DNA損傷信號(hào)通路的相關(guān)性,我們針對(duì)DNA損傷信號(hào)通路中的上游及下游中的關(guān)鍵分子 Ch2.k與H2A.X,利用Western Blot等方法檢測(cè)其在PEDV感染后磷酸化水平的變化,結(jié)果表明,Ch2.k、H2A.X的磷酸化水平隨病毒感染時(shí)間延長(zhǎng)而增加;反之,在加入ATM和Ch2.k分子的化學(xué)阻斷劑處理后,細(xì)胞周期未見明顯的阻滯現(xiàn)象,而且PEDV的增殖也受到了抑制,表明PEDV感染所引起的細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象,是由于DNA損傷信號(hào)通