組織工程方法修復大鼠棘上、棘間韌帶的實驗研究.pdf

1、目的：脊柱骨折的患者常并發(fā)棘上韌帶、棘間韌帶損傷。但是韌帶損傷后不愈合或瘢痕愈合，常導致明顯的關節(jié)功能喪失和疼痛。而且盡管韌帶損傷后可以自愈，但愈合后韌帶的超微結(jié)構及生化構成發(fā)生了很大改變，即使在韌帶愈合后若干年內(nèi)，其生物力學特性仍較正常韌帶差。近年來國內(nèi)外的學者嘗試采用生物學的方法來促進韌帶的愈合。其主要方法有細胞因子治療、基因治療和組織工程方法等。骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)．作為干細胞

2、的一種，具有多方向分化的潛能。本實驗以MSCs為種子細胞，用組織工程的方法來促進韌帶的愈合。觀察該方法促進大鼠棘上、棘間韌帶損傷愈合的效果。 方法：1.MSCs的體外培養(yǎng)。利用密度梯度離心法分離獲取大鼠股骨MSCs。以2.0×105/mL的密度接種于DMEM培養(yǎng)液中。原代細胞增殖達到鋪滿瓶底約80％時，按1：3比例進行傳代。2.細胞—膠原海綿復合體的制備。在第三代細胞的培養(yǎng)液中加入3mg/L BrdU培養(yǎng)24小時予以標記。然后用

3、胰蛋白酶消化，并制成細胞懸液，用DMEM培養(yǎng)液稀釋成10×106/mL的濃度，將其滴到已用紫外線消毒的膠原海綿上，5％ CO2孵育箱中37℃恒溫培養(yǎng)24小時，使細胞吸附于膠原海綿上制成細胞——膠原海綿復合體。3.動物模型的建立。切斷大鼠LA—L5間的棘上、棘間韌帶。實驗組將細胞—膠原海綿復合體移植于損傷處，對照組僅移植以膠原海綿。4.HE染色。于移植后第4周處死動物，切取標本，作組織學檢查。每個標本選取一張切片進行HE染色。5.免疫組化

4、染色。再次選取每個標本的切片，做免疫組化染色。胞核棕黃色者為陽性染色細胞。 結(jié)果：1.MSCs的體外培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察可見，MSCs接種3天后即有部分細胞貼壁。培養(yǎng)12—14天細胞生長成單層。傳代后，MSCs增殖明顯加快9—10天既可融合成單層。2.動物模型結(jié)果：20只動物均存活良好。3.組織學觀察結(jié)果：實驗組術后4周可見6例移植處形成韌帶樣組織，可見形態(tài)一致、排列方向與正常組織接近的成纖維細胞，類似正常韌帶組織。對照組所形

5、成的新生組織含較多脂肪組織且細胞排列紊亂，膠原纖維呈松散網(wǎng)絲狀。兩組間愈合較優(yōu)者所占比率的差異具有顯著性(P<0.05)。4.免疫組化結(jié)果：于實驗組切片可見胞核為棕褐色的陽性細胞。對照組未見陽性染色細胞。 討論：MSCs為較為理想的種子細胞。使用Ⅰ型膠原作為載體也較為合理。修復損傷韌帶的部分組織來源于移植的MSCs。MSCs在不添加外源性生長因子的情況下，可在體內(nèi)對韌帶缺損進行有效修復。實驗組韌帶恢復較好，對照組恢復的相對較差。