重組肝再生增強因子對5-6腎切除大鼠模型腎性貧血的影響.pdf

1、目的:腎性貧血是慢性腎衰竭病人常見的并發(fā)癥之一,EPO是治療腎性貧血的主要藥物,但是外源性EPO有諸多不良反應(yīng)(如高血壓、血粘度的升高、血管通路血栓形成、透析管道凝血、高鉀血癥、肌痛、流感樣癥狀等),且尚有部分病人對rHuEPO反應(yīng)低下。
　　 肝再生增生強因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是1994年Hagiya,等從新生大鼠肝臟中純化并克隆出的一種具有熱穩(wěn)定性的非特異性促進肝細胞再

2、生因子,由125個氨基酸構(gòu)成的小分子蛋白質(zhì),分子量為15 Kdat[2]。ALR具有非種屬、非組織、非器官特異性,在肝臟、腎臟中有高表達。慢性腎衰竭時腎臟不能產(chǎn)生足夠的EPO,此時由于肝臟Kupffer細胞也能合成分泌EPO,所以肝臟可有一定的代償作用[3,4]。研究發(fā)現(xiàn):肝臟Kupffer細胞表面有高親和力ALR受體,ALR能促進Kupffer細胞DNA復(fù)制,蛋白合成[4,5]。但是目前尚無肝再生增強因子(ALR)在慢性腎衰竭中的研究

3、。本課題利用5/6腎切除大鼠模型探討ALR在慢性腎衰竭中的作用,為腎性貧血探索新的治療方法。如果人工合成肝再生增強因子可以治療腎性貧血,將更符合生理要求,可減少rHuEPO的用量及其帶來的許多不良反應(yīng),為重組肝再生增強因子在臨床上治療腎性貧血提供實驗性理論依據(jù)。有可能使其成為一種理想的治療方案。
　　 方法:將體重150～200g的30只SD大鼠隨機分為三組,假手術(shù)組(n=10),僅暴露腎包膜,不做腎切除。手術(shù)組(n=20),參

4、照文獻[5][8]的方法制備模型,在嚴格無菌條件下,切除右腎,一周后切除左腎2/3。手術(shù)組大鼠術(shù)后飼養(yǎng)一周后總計成活18只,隨機分為對照組(n=9),rhALR組(n=9)。rhALR組大鼠于手術(shù)后12周給予rhALR200μg/kg/d,腹腔注射,對照組大鼠同時給予等量生理鹽水腹腔注射。隔日注射1次,共2周。觀察大鼠精神狀態(tài),活動度、毛發(fā)光澤度、攝食及死亡情況,每周觀察一次體重,觀察體重變化。各組大鼠于用藥結(jié)束后24小時,氯胺酮麻醉后

5、心臟采血,觀察各項指標。應(yīng)用日本SYSMEX型全自動血細胞分析儀測定血色素(Hb),紅細胞計數(shù)(RBC),紅細胞壓積(Hct);采用OLYMPUD AU400型生化儀測定血清尿素氮(BUN、肌酐(Scr);采用OLYMPUS5400型生化儀測定血清鐵蛋白;采用美國ADL公司ELISA試劑盒測定血清EPO水平。Masson染色觀察腎臟病理學改變,HE染色觀察肝臟病理學改變。免疫組織化學法檢測肝腎組織中的肝再生增強因子(ALR)、增殖細胞核

6、抗原(PCNA)。Western印跡法檢測肝腎組ALR蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1腎臟大體外觀改變,對照組大鼠術(shù)后殘腎體積增大,被網(wǎng)膜包裹難以剝離。手術(shù)切口瘢痕處內(nèi)陷,其余部分外凸,形狀不規(guī)則。rhALR組亦有上述改變,但較輕。
　　 2外周血象及腎功能變化:假手術(shù)組、對照組和rhALR組小鼠血Hb(g/L)分別為137.43±0.96、68.72±15.42、113.51±5.83,RBC(×1012/

7、L)分別為7.45±0.42、4.01±1.35、6.05±0.88,HCT(％)分別為46.92±6.33、25.31±2.61、39.42±5.45,BUN(mmol/L)分別為7.52±1.36、25.35±8.91、17.22±5.17,Scr(μmol/L)分別為49.64±6.20、97.72±15.43、68.88±6.84。對照組與假手術(shù)組相比,Hb、RBC、HCT等下降(P＜0.05),差異有統(tǒng)計學意義,而血Scr及B

8、UN上升(P＜0.05),差異有統(tǒng)計學意義,表明腎功能損害,造成貧血。rhALR組與假手術(shù)組比較,Hb、RBC、HCT水平仍低,Scr及BUN水平仍高(P＜0.05),差異有統(tǒng)計學意義。rhALR組與對照組比較,Hb、RBC、HCT等顯著升高(P＜0.05),而血Scr及BUN下降(P＜0.05),差異有統(tǒng)計學意義,表明貧血改善,腎功能損害減輕。
　　 3血清EPO變化假手術(shù)組、對照組和rhALR組小鼠血EPO值(u/L)分別為

9、12.19±1.87、1.77±0.72、8.64±2.35。對照組大鼠血清EPO明顯下降,rhALR治療后血清EPO升高,與對照組比較P＜0.05,差異有統(tǒng)計學意義。rhALR組與假手術(shù)組比較,EPO水平仍低,差異有統(tǒng)計學意義。表明rhALR處理后EPO分泌尚未恢復(fù)正常。
　　 4腎臟病理學變化腎臟大體外觀改變,對照組大鼠術(shù)后殘腎體積增大,被網(wǎng)膜包裹難以剝離。手術(shù)切口瘢痕處內(nèi)陷,其余部分外凸,形狀不規(guī)則。rhALR組亦有上述改

10、變,但較輕。組織解剖學改變假手術(shù)組腎臟外觀光滑,腎小球、腎小管、腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常。對照組大鼠腎臟外觀明顯增大,呈蒼白色,表面凸凹不平,腎盂擴張;光鏡下Masson染色顯示鼠腎小球代償性肥大、系膜增生、局灶節(jié)段性腎小球硬化;腎小管萎縮,小管細胞可見變性、壞死、脫落;腎間質(zhì)膠原成分增多,部分腎間質(zhì)纖維化,局灶淋巴-單核細胞浸潤伴有炎性細胞浸潤。rhALR組腎小球、腎小管、腎間質(zhì)纖維組織增生病變程度明顯減輕。
　　 5腎組織ALR的表達

11、變化:假手術(shù)組大鼠腎組織ALR僅在腎小管上皮細胞有少量表達,表現(xiàn)為腎小管上皮細胞包膜及胞漿均勻分布的細沙粒樣著色。皮質(zhì)區(qū)表達陰性。與假手術(shù)組相比,對照組ALR在腎小管上皮細胞表達增加(9.53±0.73vs.13.58±0.69,P＜0.05),而rALR組表達較對照組明顯上調(diào)(17.05±1.23vs.13.58±0.69,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。rhALR組與假手術(shù)組比較,(17.05±1.23vs.9.53±0.73,

12、P＜0.05),差異有統(tǒng)計學意義。在假手術(shù)組及腎衰大鼠腎小球內(nèi)未見ALR表達。
　　 6肝組織ALR的表達變化:假手術(shù)組大鼠肝組織ALR僅有少量肝細胞表達;與假手術(shù)組相比,對照組肝臟ALR陽性細胞數(shù)增多(10.00±0.89vs.13.56±1.33,P＜0.01);rALR組ALR陽性細胞數(shù)較對照組明顯增多(23.01±1.22vs.13.56±1.33,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。rhALR組與假手術(shù)組比較,(23.

13、01±1.22vs.10.00±0.89,P＜0.05),差異有統(tǒng)計學意義。
　　 7腎組織PCNA的表達變化:假手術(shù)組大鼠腎組織PCNA僅在腎小管上皮細胞有極少量表達,與假手術(shù)組相比,對照組組PCNA表達(％)增加(0.73±0.08vs.6.08±0.68,P＜0.05),而rALR組表達較對照組明顯上調(diào)(12.30±0.74vs.6.08±0.68,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。rhALR組與假手術(shù)組比較,(12.3

14、0±0.74vs.0.73±0.08,P＜0.05),差異有統(tǒng)計學意義。
　　 8肝組織PCNA的表達變化:假手術(shù)組大鼠肝組織PCNA僅在肝細胞有少量表達,與假手術(shù)組相比,對照組PCNA表達增加(2.33±0.11vs.8.27±0.30,P＜0.05),而rALR組表達較對照組明顯上調(diào)(12.19±0.27vs.8.27±0.30,P＜0.05)差異具有統(tǒng)計學意義。rhALR組與假手術(shù)組比較,(12.19±0.27vs.2.3

15、3±0.11,P＜0.05),差異有統(tǒng)計學意義。
　　 9 Western blot實驗?zāi)I組織ALR蛋白表達情況:與假手術(shù)組相比,對照組ALR蛋白表達增加(0.62±0.02vs.0.69±0.03,P＜0.05),而rALR組表達較對照組顯著增加(0.82±0.05vs.0.69±0.03,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 10 Western blot實驗肝組織ALR蛋白表達情況:與假手術(shù)組相比,對照組AL

16、R蛋白表達增加(0.75±0.03vs.0.80±0.05,P＜0.05),而rALR組表達較對照組明顯增加(0.89±0.02vs.0.80±0.05,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計學意義。rhALR組與假手術(shù)組比較,(0.89±0.02vs.0.75±0.03,P＜0.05),差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論:
　　 15/6腎切除大鼠制作慢性腎衰竭動物模型,盡管這一方法復(fù)雜,但其機理明確,即通過減少腎組織導(dǎo)致腎功能衰竭

17、,進一步并發(fā)貧血,模型成功率高。從生化、病理和代謝等方面接近人類慢性腎衰竭,從而有助于探討慢性腎性貧血的發(fā)病機制。
　　 25/6腎切除大鼠慢性腎衰竭動物模型中,肝腎組織ALR表達增加,可能為表明腎功能損害,造成貧血,肝臟腎臟ALR反應(yīng)性增加,為機體代償機制。
　　 3外源性給予rhALR后,5/6腎切除慢性腎衰竭大鼠血EPO水平升高,貧血改善。腎臟病理間質(zhì)纖維化改變減輕,肝腎組織ALR、PCNA表達明顯上調(diào),與EPO升