ALV-J gp85真核表達(dá)載體構(gòu)建及免疫原性研究.pdf

1、利用真核表達(dá)載體制備DNA疫苗和真核重組亞單位疫苗是臨床生產(chǎn)中防治病毒感染的極具潛力的重要手段，能否利用它們制備出J亞群禽白血病病毒(ALV-J)的具有保護(hù)性疫苗抗原尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　本研究利用PVAX-1載體和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)分別構(gòu)建了PVAX1-gp85 DNA表達(dá)載體和pPIC9-gp85蛋白表達(dá)載體;對(duì)構(gòu)建的PVAX1-gp85 DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物Hela細(xì)胞和雞成纖維細(xì)胞(CEF)，再與核酸佐劑聯(lián)合免疫雛雞，觀察

2、對(duì)血清抗體的誘導(dǎo)效果;對(duì)pPIC9-gp85蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至酵母感受態(tài)GS115中，用一定濃度的甲醇誘導(dǎo)，得到特異性gp85重組蛋白;通過(guò)多次免疫家兔，制備抗ALV-Jgp85的血清，使用ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)制備抗體的特異性;同時(shí)，利用其作為免疫原聯(lián)合不同佐劑免疫7日齡雛雞，動(dòng)態(tài)檢測(cè)血清抗體以及攻毒后的病毒血癥、免疫器官發(fā)育變化等指標(biāo)分析其免疫保護(hù)效果，并經(jīng)體外病毒中和試驗(yàn)和IFA檢測(cè)血清中的中和

3、抗體。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明，(1)PVAX1-gp85真核質(zhì)粒構(gòu)建成功，并能在Hela細(xì)胞和CEF細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)，免疫雛雞后誘導(dǎo)產(chǎn)生血清抗體顯著高于對(duì)照組和空載體質(zhì)粒免疫組;在整個(gè)試驗(yàn)觀察期，有9只雞只（約82％）產(chǎn)生明顯的抗體反應(yīng)，有2只（約27％）始終沒(méi)有產(chǎn)生抗體反應(yīng)，病毒血癥檢測(cè)免疫保護(hù)率為75％。(2)凝膠電泳和基因測(cè)序表明用于酵母表達(dá)的pPIC9-gp85重組真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，Western-blotting結(jié)果證明

4、能夠表達(dá)gp85目的蛋白，使用該蛋白免疫家兔后能產(chǎn)生高效價(jià)抗gp85蛋白的血清抗體;使用酵母表達(dá)重組蛋白聯(lián)合兩種佐劑免疫雛雞后，抗體產(chǎn)生比蛋白免疫組要早，且抗體效價(jià)高，維持時(shí)間長(zhǎng);加強(qiáng)免疫也進(jìn)一步促進(jìn)抗體的生成，維持時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，抗體陽(yáng)性率最高達(dá)86％(6/7)和89％(8/9)，對(duì)攻毒后的免疫保護(hù)率為67％和75％。(3)血清抗體體外病毒中和試驗(yàn)結(jié)果表明，未用免疫血清中和的三個(gè)劑量的ALV-J毒株在細(xì)胞增殖的5d內(nèi)均被檢測(cè)出;對(duì)較低

5、劑量的（101.625 TCID50或102.625 TCID50）病毒，使用免疫雛雞的抗血清中和后，在5d內(nèi)均未檢測(cè)出;對(duì)于較高劑量的(103.625 TCID50)病毒，使用不同滴度的抗血清的中和后先后被檢測(cè)出，呈現(xiàn)與抗血清滴度明顯的相關(guān)性。通過(guò)IFA檢測(cè)表明，抗血清中含有中和病毒Ig抗體，證實(shí)其對(duì)病毒的直接作用。本研究為進(jìn)一步開(kāi)展J亞群禽白血病的DNA疫苗和亞單位疫苗的應(yīng)用研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也為其ALV-J疫苗抗原制備提供了新的技