一株鼠抗人4-1BBL功能性單克隆抗體的研制及生物學(xué)特性的研究.pdf

1、4-1BBL(CD137L)是Ⅱ型跨膜糖蛋白分子，TNF超家族成員，表達(dá)于各種活化的抗原提呈細(xì)胞(APC)表面，如IFN-γ活化的巨噬細(xì)胞、CD40配體活化的B細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)、T細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。編碼人4-1BBL的基因位于19p13.3。其受體4-1BB(CD137)為TNF受體(TNFR)超家族成員，分子量為30KD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，表達(dá)于活化的CD4+T和CD8+T細(xì)胞表面。4-1BB/4-1BBL介導(dǎo)的協(xié)同刺

2、激信號(hào)可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化，增殖及抗凋亡作用，同時(shí)還可維持T細(xì)胞的長(zhǎng)期生存及提高細(xì)胞因子的分泌。4-1BB/4-1BBL，可以協(xié)同CD28/B7促進(jìn)T細(xì)胞IL-2的分泌，4-1BBL亦可獨(dú)立于CD28傳遞協(xié)同刺激信號(hào)聯(lián)合TCR信號(hào)參與T細(xì)胞的活化，并在初次免疫應(yīng)答的后期，二次免疫應(yīng)答及免疫記憶中發(fā)揮效應(yīng)。4-1BBL還可介導(dǎo)逆向信號(hào)誘導(dǎo)單核細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的增殖及促進(jìn)其細(xì)胞因子的分泌。這種逆向信號(hào)可能在腫瘤免疫應(yīng)答中起至關(guān)重要的作用。4-

3、1BBL分子的激動(dòng)劑或拮抗劑的研制及其在4-1BB/4-1BBL信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)作用的研究在腫瘤、移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病中具有重要的理論研究意義和應(yīng)用價(jià)值。 1.本研究以4-1BBL轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株L929/4-1BBL為免疫原，免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，將免疫后小鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，以L929/4-1BBL細(xì)胞株作為陽(yáng)性細(xì)胞株，以轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的母本細(xì)胞L929作為陰性對(duì)照細(xì)胞株

4、，經(jīng)免疫熒光標(biāo)記分析及抗體分泌陽(yáng)性孔內(nèi)細(xì)胞的反復(fù)篩選并經(jīng)多次的克隆化培養(yǎng)，最終獲得1株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人4-1BBL單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3E7。經(jīng)體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)和液氮凍存后復(fù)蘇，雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)良好，分泌抗體的性能穩(wěn)定。該抗體效價(jià)在1∶1000以上，純化后抗體蛋白用于間接免疫熒光分析的用量為0.25～2.0μg/1×106細(xì)胞。經(jīng)快速定性試紙法鑒定單抗3E7的重鏈為IgG1。單抗3E7與商品化單抗C65-485識(shí)別4-1B

5、BL，分子的抗原位點(diǎn)不同。 2.為了研究單克隆抗體對(duì)4-1BBL分子表達(dá)細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合，選擇表達(dá)4-1BBL膜分子的人單核性白血病細(xì)胞株U937以及SHI-1、人早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60、人紅白血病細(xì)胞株K562、惡性B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi和骨髓瘤細(xì)胞株8226，通過(guò)間接免疫熒光標(biāo)記法及流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果顯示，單抗3E7能特異性的地識(shí)別上述血液系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞株上表達(dá)的4-1BBL分子。 3.經(jīng)過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、光鏡

6、觀察及流式細(xì)胞儀分析證實(shí)單抗3E7能介導(dǎo)逆向信號(hào)誘導(dǎo)人單核細(xì)胞在體外有效擴(kuò)增(3～4倍)，進(jìn)一步用ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清，結(jié)果顯示，單抗3E7能有效地促進(jìn)單核細(xì)胞分泌IL-6和TNF-a。 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞表面表達(dá)4-1BBL膜蛋白；與流式結(jié)果相應(yīng)，RT-PCR檢測(cè)到HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞有4-1BBL mRNA胞外段轉(zhuǎn)錄本，可見HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞膜表面組成性表達(dá)4-1

7、BBL分子。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，4-1BBL單抗3E7能顯著促HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞的體外生長(zhǎng)，提示HL-60細(xì)胞和U937細(xì)胞上的4-1BBL分子同樣能夠介導(dǎo)逆向信號(hào)，并且通過(guò)逆向信號(hào)促進(jìn)這兩種白血病細(xì)胞株的生長(zhǎng)，促進(jìn)其分泌IL-6，使之進(jìn)入S期的細(xì)胞比例增加。 5.用4-1BBL單抗3E7和TLR-4商品抗體標(biāo)記HL-60細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HL-60細(xì)胞組成性共表達(dá)4-1BBL分子和TLR-4分子，激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)到HL-6

8、0細(xì)胞上存在4-1BBL與TLR-4的共定位現(xiàn)象。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4-1BBL與TLR-4在37℃條件下出現(xiàn)了共內(nèi)吞，由此表明4-1BBL確實(shí)在功能上與TLR-4有一定的關(guān)系。 綜上所述，本研究成功的地獲得了1株穩(wěn)定和特異分泌抗人4-1BBL的功能性單克隆抗體的雜交瘤(3E7)，證實(shí)所分泌的抗人4-1BBL單克隆抗體通過(guò)逆向信號(hào)顯著地誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞的體外生長(zhǎng)。單抗3E7可促進(jìn)白血病腫瘤細(xì)胞株HL-60和U937體外生長(zhǎng)和細(xì)