獨蒜蘭組織培養(yǎng)及其生物多樣性的ISSR分析.pdf

1、獨蒜蘭屬是蘭科植物十分重要的一個屬，全屬約有23種。我國約有16個種。獨蒜蘭一般為陸生、巖生或附生于從海拔1000米到4200米亞熱帶山區(qū)，主要以喜馬拉雅區(qū)域為主。我國在野外收集獨蒜蘭種質(zhì)資源主要為園藝需要，雖然小部分種類可以通過種子的萌發(fā)繁殖及馴化，但是大部分還是野外采集為主。大多數(shù)獨蒜蘭只有一個葉片,有皺褶，一般在冬季凋落，少有宿存。獨蒜蘭的花一般為粉紅色，也有白色和黃色，但較少。萼片離生，唇瓣明顯大于萼片，不裂或不明顯3裂，基部上

2、部邊緣嚙蝕狀或撕裂狀，上面具有2至數(shù)條縱皺褶片或沿脈具有流蘇狀毛。近幾年，雖然有一些研究關(guān)于獨蒜蘭從萌發(fā)到形成小植株的報道，但是目前來講，國內(nèi)外還沒有系統(tǒng)地進行獨蒜蘭屬的離體繁殖、植株再生和分子方面的研究，本研究選擇我國云南以及越南共13個獨蒜蘭品種，從細胞學(xué)和DNA分子角度，分析了它們的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)狀況，對毛唇獨蒜蘭以及其他多個種的離體繁殖技術(shù)進行了研究，得出如下結(jié)論： 1.以獨蒜蘭的原球莖切塊作為外植體進行快速繁

3、殖的研究，結(jié)果表明：在1/2MS培養(yǎng)基中，6-BAlmg/L時外植體誘導(dǎo)叢生芽的出芽率最高；在TH培養(yǎng)基中，NAA0.2mg/L+6-BAlmg/L時外植體誘導(dǎo)叢生芽的出芽率最好，并且增殖倍數(shù)比1/2MS多。用于誘導(dǎo)叢生芽的原球莖切塊大小應(yīng)大于0.5×0.5×0.5cm<'3>。原球莖切塊在光照長度12小時/天、光照強度為800-12001x以及溫度25±2℃培養(yǎng)。秋花獨蒜蘭(Pleione maculate)在TH+NAA0.2mg/

4、L+6-BAlmg/L下叢生芽誘導(dǎo)率為100％；毛唇獨蒜蘭a(Pleione hookeriana)相同培養(yǎng)基下的叢生芽誘導(dǎo)率為93％，在1/2MS+6-BAlmg/L 下叢生芽的誘導(dǎo)率為80％；陳氏獨蒜蘭(Pleione chunii)在1/2MS+NAA0.2mg/L+6-BAlmg/培養(yǎng)基下的叢，生芽的誘導(dǎo)率位為75％；黃花獨蒜蘭(Pleione forrestii)在1/2MS+NAAlmg/L+6-BA0.2mg/L 培養(yǎng)基的

5、培養(yǎng)下叢生芽的誘導(dǎo)率都為100％；大花獨蒜蘭(Pleione grandiflora)在1/2MS+6-BAlmg/L 下誘導(dǎo)率為60％；四川獨蒜蘭(Pleione limprichtii)在1/2MS+NAA0.2mg/L+6-BAlmg/L下誘導(dǎo)率為80％；耳瓣獨蒜蘭(Pleione aurita)在1/2MS+NAA0.2mg/L+6-BA2mg/L下叢生芽的誘導(dǎo)率為75％。培養(yǎng)基TH+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg

6、/L+土豆50g/L 可作為繼代培養(yǎng)基復(fù)壯叢生芽。在1/2MS培養(yǎng)基中，0.5mg/LNAA和0.5mg/L6-BA有利于獨蒜蘭的叢生芽的生根。同時通過對原球莖的進一步切割也有利于其本身的增殖，但切割方式上一刀切割原球莖的增殖率要高于兩刀切割的增殖率。 2.用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對獨蒜蘭屬種間共13個樣以及同種不同個體間進行了PCR擴增。擴增結(jié)果為：從100個引物中篩選出5個擴增條帶多，信號強，背景清晰的引物，分別是(AC)<,

7、8>T、(TG)<,8>C、(CT)<,8>RG等5個引物，除895和58R外其共同特征是C和A兩個堿基的8個串聯(lián)重復(fù)以及CT和TG兩個堿基對的串聯(lián)重復(fù)，說明獨蒜蘭屬DNA分子中廣泛存在著CA或AC以及CT或TG的串聯(lián)重復(fù)序列。5個ISSR引物和引物58R對獨蒜蘭的13個種進行了PCR擴增，5個引物共得到265條擴增帶，每個引物對于13個種的獨蒜蘭種共可擴增出37-97條多態(tài)性帶，平均53條，DNA片斷大小分布在200-1500bp之間

8、。多樣性分析結(jié)果為：獨蒜蘭同種不同個體間的擴增沒有出現(xiàn)特異性條帶，表明獨蒜蘭同種不同個體間具高度的遺傳一致性；獨蒜蘭屬13個種的擴增電泳圖譜經(jīng)POPGENE軟件分析，表明毛唇獨蒜蘭b與美麗獨蒜蘭以及四川獨蒜蘭的距離最遠，其次是四川獨蒜蘭和大花獨蒜蘭的距離，巖生獨蒜蘭與秋花獨蒜蘭和疣鞘獨蒜蘭有較低的相異系數(shù)，秋花獨蒜蘭和疣鞘獨蒜蘭的距離最小。UPGMA聚類結(jié)果顯示，13種獨蒜蘭主要聚類分布為：秋花、疣鞘和巖生聚成一支，毛唇b和獨蒜蘭聚成一