順鉑逆轉(zhuǎn)鼻咽癌紫杉醇耐藥分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：順鉑逆轉(zhuǎn)鼻咽癌紫杉醇耐藥細(xì)胞系的耐藥性
　　 目的：比較順鉑對鼻咽癌細(xì)胞CNE-1及其紫杉醇耐藥細(xì)胞系CNE-1/taxol生長抑制率的差異，觀察順鉑對鼻咽癌紫杉醇耐藥細(xì)胞系CNE-1/taxol耐藥性的影響。
　　 方法：以CNE-1和CNE-1/taxol為實(shí)驗(yàn)對象，通過集落形成試驗(yàn)檢測順鉑對CNE-1和CNE-1/taxol的敏感性；運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測順鉑對細(xì)胞凋亡的影響

2、；等效劑量分析紫杉醇和順鉑聯(lián)合作用兩種細(xì)胞產(chǎn)生的效用。
　　 結(jié)果：紫杉醇處理CNE-1和CNE-1/taxol后，其IC50值分別為1.33±0.05nmol/L和11.24±0.51nmol/L，顯示CNE-1/taxol的耐藥指數(shù)為8.43；不同劑量(300nmol/L、600nmol/L、900nmol/L、1200nmol/L和1500nmol/L)的順鉑作用于兩種細(xì)胞后，通過集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)順鉑作用于CNE-1/ta

3、xol的IC50值為591.1±23.2nmol/L，而作用于CNE-1的IC50值為1269.6±52.2nmol/L，顯示出CNE-1/taxol對順鉑的敏感性顯著高于CNE-1對順鉑的敏感性(p＜0.01)；低劑量順鉑(IC20)預(yù)處理細(xì)胞后，紫杉醇對CNE-1/taxol生長抑制的IC50值為5.34±0.29nmol/L，耐藥指數(shù)下降為4.02，其敏感性顯著增加(p＜0.01)，而CNE-1對紫杉醇的敏感性沒有因順鉑的預(yù)處理發(fā)

4、生明顯變化(P＞0.05)；當(dāng)紫杉醇和順鉑聯(lián)合作用CNE-1/taxol，CI值均小于1，表明兩藥具有協(xié)同作用。不同劑量順鉑(300～1500nmol/L)作用于兩種細(xì)胞后，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測其凋亡率，發(fā)現(xiàn)5個(gè)濃度順鉑使耐藥細(xì)胞(CNE-1/taxol)的凋亡率顯著高于親本細(xì)胞(CNE-1)的凋亡率(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：紫杉醇耐藥細(xì)胞系CNE-1/taxol對順鉑的敏感性高于親本細(xì)胞CNE-1對順鉑的敏感性；順鉑能夠逆

5、轉(zhuǎn)CNE-1/taxol對紫杉醇的耐藥性。
　　 第二部分：應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選鼻咽癌紫杉醇耐藥及耐藥逆轉(zhuǎn)相關(guān)基因的表達(dá)
　　 目的：應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選鼻咽癌紫杉醇耐藥及耐藥逆轉(zhuǎn)相關(guān)基因的表達(dá)譜，試圖發(fā)現(xiàn)與鼻咽癌紫杉醇耐藥及耐藥相關(guān)的基因。
　　 方法：使用AffymetrixHG-U133Plus2.0基因芯片對紫杉醇和順鉑分別處理前后的CNE-1及CNE-1/taxol細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模的基因差異表達(dá)的檢測，并

6、進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 結(jié)果：經(jīng)過多重分析與篩選，297個(gè)基因可能與紫杉醇耐藥及耐藥逆轉(zhuǎn)相關(guān)。在耐藥細(xì)胞系下調(diào)、而順鉑使之上調(diào)的基因有133個(gè)，這些基因涉及到了血管形成、凋亡、細(xì)胞生長等方面；在耐藥細(xì)胞系上調(diào)、而順鉑使之下調(diào)的基因164個(gè)，主要涉及類固醇的合成和代謝，以及細(xì)胞的生長和凋亡等方面。其中改變超過5倍以上的基因有TSP1、LAMC2、PSG7、NRG1、KRT14、AKAP12、G0S2、TMEM40、MYEOV、SER

7、PINA3、CFI、MAOA、MYOM2、METTL7A、FOS、NOV、ABP1。通過對已知耐藥相關(guān)基因的分析，結(jié)果顯示：
　　 1.具有藥物轉(zhuǎn)運(yùn)作用的ATP結(jié)合盒家族中MDR1基因在各樣本中都沒有出現(xiàn)陽性表達(dá)；出現(xiàn)差異表達(dá)的家族成員中，有個(gè)8基因表達(dá)上調(diào)，而順鉑處理沒有使這8個(gè)基因的表達(dá)下降。
　　 2.P450家族中CYP1A1在親本細(xì)胞中不表達(dá)，在耐藥細(xì)胞中出現(xiàn)了較強(qiáng)的陽性表達(dá)，經(jīng)紫杉醇處理后，其表達(dá)進(jìn)一步大幅下

8、調(diào)，順鉑處理后其表達(dá)下調(diào)。
　　 3.腫瘤壞死因子家族中在耐藥細(xì)胞系表達(dá)下調(diào)的有TNFAIP1、3、6、8和腫瘤壞死因子受體TNFRSF10B、12A、21。其中經(jīng)順鉑處理后出現(xiàn)逆向表達(dá)增強(qiáng)的基因有TNFAIP1、3和TNFRSF12A、21。
　　 4.Caspase家族除CASP4在耐藥細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，經(jīng)順鉑處理后，其表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，而在紫杉醇作用后，表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)。CASP6在耐藥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，經(jīng)順鉑處理后，其表達(dá)

9、出現(xiàn)了下調(diào)，其余的Caspase家族成員的表達(dá)變化都不明顯或者不表達(dá)。
　　 5.與紫杉醇耐藥相關(guān)的β-微管蛋白同型中除β-微管蛋白Ⅱ出現(xiàn)差異表達(dá)外，β-微管蛋白Ⅲ、Ⅵ在各樣本中表達(dá)差異不明顯(p＜0.05)，β-微管蛋白Ⅰ、Ⅳ在6個(gè)樣本中都沒有出現(xiàn)陽性表達(dá)6.紫杉醇耐藥基因TXR1在耐藥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，經(jīng)紫杉醇和順鉑處理后，其表達(dá)變化均不明顯。凝血酶敏感蛋白TSP1基因在耐藥細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，經(jīng)紫杉醇處理后，表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，但是

10、，經(jīng)順鉑作用后，其表達(dá)出現(xiàn)了明顯的上調(diào)。
　　 結(jié)論：17個(gè)顯著變化的基因可能與鼻咽癌紫杉醇耐藥及耐藥逆轉(zhuǎn)相關(guān)，如TSP1、LAMC2等。目前認(rèn)為與紫杉醇耐藥相關(guān)基因中的ATP-結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體家族、β微管蛋白都不是CNE-1/taxol耐藥性產(chǎn)生過程中的關(guān)鍵因素；凋亡相關(guān)基因Caspase家族表達(dá)與CNE-1/taxol耐藥性無關(guān)，而腫瘤壞死因子家族的部分基因可能參與了鼻咽癌紫杉醇耐藥；CYP1A1的表達(dá)改變可能與CNE-1/ta

11、xol的耐藥及耐藥逆轉(zhuǎn)有一定的相關(guān)性。
　　 第三部分：TXR1/TSP1信號(hào)通路與鼻咽癌紫杉醇耐藥及耐藥逆轉(zhuǎn)的關(guān)系
　　 目的：探討TXR1/TSP1信號(hào)通路在鼻咽癌紫杉醇耐藥及耐藥逆轉(zhuǎn)中的作用。
　　 方法：通過RT-PCR、免疫熒光和westernblot，在mRNA及蛋白質(zhì)水平對基因的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)，運(yùn)用不同的藥物劑量處理CNE-1和CNE-1/taxol，觀察TSP1的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果

12、：通過RT-PCR試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TXR1在CNE-1/taxol的表達(dá)大約是CNE-1的7倍；而TSP1在mRNA和蛋白質(zhì)水平分別下調(diào)了8.9和5.6倍；經(jīng)591.1nmol/L(IC50)順鉑作用24h后，CNE-1/taxol中TSP1在mRNA水平表達(dá)上調(diào)了8.7倍，經(jīng)300nmol/L～1500nmol/L順鉑作用后，隨著藥物濃度的增加，TSP1蛋白的表達(dá)隨之上調(diào)；然而，兩種細(xì)胞經(jīng)順鉑作用后，TXR1的表達(dá)都沒有出現(xiàn)明顯的改變。