納米載體介導的Livin RNAi治療大腸癌的實驗研究.pdf

1、大腸癌是臨床上常見的消化道腫瘤之一，且大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升。而腫瘤的發(fā)生是細胞增殖與凋亡失衡所致，凋亡抑制是腫瘤發(fā)生的重要機制。凋亡的調節(jié)機制非常復雜，近年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族(IAP)是一類重要的分子水平的抗凋亡調節(jié)因子，Livin是新近發(fā)現(xiàn)的一個IAP家族成員，研究表明，Livin在多數(shù)腫瘤中表達，而在除胎盤外的大多數(shù)終末分化組織中低表達或不表達。在大多數(shù)研究livin在腫瘤中的表達中，認為高表達的Livin mRNA和蛋白是

2、腫瘤進展的預兆標記，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后相關。因此許多種以IAP為靶點的抗腫瘤研究多聚焦于Livin，通過調控Livin基因也許可以為腫瘤的治療提供新靶點。Livin與大腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉移及預后等關系及針對Livin治療大腸癌研究目前國內外還未見詳細報道。 RNA干擾技術(RNAi)是近年發(fā)展起來的新技術，RNAi引發(fā)的基因沉默作用是特異的和有效的，具有抑制作用強、穩(wěn)定性高、細胞攝取相對容易等優(yōu)點，為腫瘤的基因治療提供新的

3、、有前途的手段。是當前基因治療研究最廣為應用的基因沉默工具。小干擾RNA(siRNA)選擇性抑制基因表達使基因治療達到最大的特異性，但是弱小的細胞內導入能力、有限的血液穩(wěn)定性及非特異的免疫原性阻礙了siRNA基因治療的發(fā)展。目前，國內外的研究都沒能有效解決將siRNA導入體內轉染細胞的效率低下的問題。 基因轉運需要合適的載體，理想的基因轉運系統(tǒng)，應具有較高的基因轉染效率、良好的靶向性和生物相容性、較高的穩(wěn)定性及生物可降解性。目前

4、的病毒載體和非病毒脂質體載體都存在不同程度的缺陷，因而尋找一種理想的基因載體就成為當務之急。納米基因轉運體的研制是目前國際納米生物和腫瘤基因治療研究領域重要的前沿性課題。納米顆粒體積小，可在血管中隨血液循環(huán)、透過血管壁進入各個臟器的細胞中，作為新型非病毒型基因載體能有效介導DNA的轉導，并使其在細胞內高水平的表達，從而為基因表達、功能研究及基因治療提供了新的技術和手段。殼聚糖(CS)是一種天然多聚糖，已有研究表明，殼聚糖納米粒有良好的生

5、物相容性和生物可降解性，且可通過修飾改性增加其靶向性和緩釋性，是一種良好的基因載體。我們擬通過接枝共聚的方法將親水無毒的聚乙二醇(PEG)鏈段引入殼聚糖鏈段中以增加其水溶性和緩釋性，從而增加基因轉染效率。 基于以上背景和已有的研究成果，我們先用RT-PCR和Westernblot方法分別從mRNA和蛋白質水平檢測Livin基因的表達情況及與大腸腫瘤特性的相關性。結果顯示，在所有的癌旁和正常組織中，Livin均不表達，而在腫瘤組織

6、中，陽性表達率卻達45.5％，兩種方法的檢測結果一致，說明Livin是大腸癌的一種標志物，這不僅有助于大腸癌的診斷，而且可以為大腸癌的生物治療提供依據(jù)；分析Livin表達與結直腸癌患者主要臨床參數(shù)之間的關系后發(fā)現(xiàn)，Livin在結直腸癌中表達情況與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、組織學類型、淋巴是否轉移、Dukes分期均無顯著相關性，而與患者遠處轉移及放化療密切相關(p<0.05)，提示Livin的表達可以影響結直腸癌的生物學行為，使其更

7、易發(fā)生遠處轉移等惡性行為，是預后不良的指征之一；在放化療后腫瘤組織中Livin表達也明顯升高，提示其與腫瘤的耐藥性有關。可能為大腸癌的診斷和預后判斷提供新的分子生物學指標，同時也為下一步的腫瘤基因治療提供了實驗基礎。 在第二部分，我們設計、合成了Livin shRNA，與pGenesil-1質粒載體鏈接構建重組質粒，通過酶切電泳、基因測序證實是否正確構建，通過轉染高表達Livin的大腸癌HT-29細胞檢測Livin mRNA下降

8、水平，篩選出最佳的shRNA。結果重組質粒pGenesil-shRNA經酶切電泳、基因測序證明寡核苷酸片段成功插入預計位點，且序列與我們設計合成的完全一致，說明我們成功地構建shRNA真核表達載體pGenesil-shRNA重組質粒；重組質粒載體轉染HT-29細胞后，腫瘤細胞livin mRNA含量較轉染前及對照組均有明顯的下降(p<0.01)，說明我們制備的shRNA能有效抑制Livin基因的表達，其中尤以Livin1抑制作用明顯，抑

9、制率達到66％。故在后續(xù)研究中，我們均以Livin1作為實驗模板，探討針對Livin基因的RNAi對腫瘤的治療作用。 第三部分先通過接枝共聚的方法制備殼聚糖-聚乙二醇(CS-PEG)納米粒，用透射電鏡、激光粒度分析儀考察其形態(tài)、粒徑、ζ電位，MTT法考察其細胞毒性，不同的基因/納米粒材料比制備基因納米復合物，通過其形態(tài)、粒徑、ζ電位、載藥量、包封率、基因保護實驗考察藥物的理化特性，轉染后EGFP蛋白表達和LivinmRNA抑制率

10、比較考察基因轉染效果。結果制備的空白納米粒粒徑約60nm，細胞毒性較脂質體要低；在基因：納米粒為1:5時(質量比)制備的基因納米復合物粒徑約為120nm，ζ電位為6.6mV，包封率和載藥量分別為79.4％和32.3％，對基因有較好的保護作用，選此條件下制備的基因納米復合物進行基因轉染，持續(xù)作用時間較脂質體和裸基因均要長，轉染72h后的Livin mRNA抑制率較兩對照組明顯增強(分別為p<0.05和p<0.01)。故后續(xù)研究中以此基因納

11、米復合物進行基因治療研究。 第四部分為納米載體介導的RNAi治療結腸癌研究。培養(yǎng)HT-29結腸癌細胞后，以基因納米復合物轉染，72h后用RT-PCR和westernblot檢測Livin mRNA和蛋白質抑制率，用流式細胞儀及熒光顯微鏡檢測細胞凋亡情況，從體外考察基因治療效果；建立裸鼠結腸癌動物模型，以基因納米復合物作瘤內多次注射，繪制腫瘤生長曲線，24d后切取腫瘤檢測體積抑制率和瘤重抑制率，組織切片TUNEL法檢測細胞凋亡指數(shù)

12、(AI)，從動物在體模型考察基因治療效果。結果發(fā)現(xiàn)試驗組Livin mRNA和蛋白質的抑制率為78％和76％，較假性治療組顯著增強(p<0.01)；試驗組的腫瘤生長明顯減慢，瘤重抑制率和體積抑制率分別為74％和80％，較假性治療組明顯增強(p<0.01)；切片組織的凋亡細胞較對照組明顯增多，AI增高(p<0.01)。說明我們制備的CS-PEG納米載體介導的Livin shRNA對Livin高表達的結腸癌有很好的治療效果。 本研究