DNA甲基化在大鼠肝纖維化中的作用及其部分機制研究.pdf

1、肝纖維化是慢性肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中的共有病理反應(yīng),活化的肝星狀細胞分泌ECM增多是其發(fā)病的主要特征,因此肝星狀細胞(HSC)活化被認為是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié),抑制HSC活化是抗肝纖維化治療關(guān)鍵步驟。研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在HSC活化過程中具有重要作用。為了進一步探討DNA甲基化在肝纖維化中的作用機制,通過在體與離體兩個方面觀察DNA甲基化相關(guān)蛋白在肝組織與細胞中的變化,及其對HSC活化的影響,并探討其部分作用機制。研究內(nèi)容主要包括以下

2、四個部分:
　　1.PTEN在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝組織中的表達及甲基化的狀態(tài)
　　CCl4皮下注射建立大鼠肝纖維化模型,正常組10只、模型組20只。自處理之日開始,模型組大鼠皮下注射50％CCl4植物油溶液(1ml/kg)每周2次,共12周;正常組給予同樣劑量花生油皮下注射,在12周末,取肝組織進行病理組織學(xué)和Masson膠原染色檢測,并檢測PTEN、α-SMA在大鼠肝組織中的表達變化。實驗結(jié)果表明,在肝纖維化形成過程中PT

3、EN表達降低。利用甲基化特異性PCR(MSP-PCR)檢測PTEN甲基化的狀態(tài),發(fā)現(xiàn)在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝組織中PTEN發(fā)生了高甲基化。
　　2.DNA甲基化抑制劑使PTEN發(fā)生去甲基化及恢復(fù)了PTEN的表達,從而抑制HSC的活化
　　以大鼠肝星狀細胞株HSC-T6為研究對象,利用TGF-?15ng/ml刺激30m后,加入不同濃度的5-AzadC溫育48h,RT-PCR方法檢測PTEN,α-SMA,CollagenI的mRN

4、A表達變化;免疫印跡觀察PTEN,α-SMA蛋白的表達。利用甲基化特異性PCR(MSP-PCR)檢測PTEN甲基化的狀態(tài)。實驗結(jié)果表明,在體外TGF-?1誘導(dǎo)HSC-T6中PTEN高甲基化,5-AzadC能使高甲基化的PTEN去甲基化進而恢復(fù)PTEN表達,并可抑制HSC-T6的活化。
　　3.DNMT1調(diào)控PTEN表達及其對甲基化的作用研究
　　根據(jù)DNMT1的堿基序列設(shè)計并合成小干擾RNA(smallinterfering

5、RNA,siRNA),通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染到HSC-T6細胞內(nèi),熒光倒置顯微鏡觀察細胞的轉(zhuǎn)染效率,用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測HSC-T6的細胞增殖變化;RT-PCR檢測DNMT1、α-SMA、CollagenImRNA的表達;免疫組化,免疫熒光及WesternBlot檢測DNMT1、α-SMA蛋白的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),靶向沉默DNMT1可明顯降低TGF-?1刺激的HSC-T6中α-SMA、Collage

6、nI基因的表達水平;MSP-PCR檢測顯示,靶向封閉DNMT1基因的表達可使PTEN去甲化,進而抑制HSC-T6細胞的活化增殖。實驗結(jié)果表明,DNMT1通過介導(dǎo)PTEN甲基化來促進HSC-T6活化。
　　4.DNA甲基化抑制劑和DNMT1沉默對PTEN下游信號通路的影響
　　Westernblot檢測發(fā)現(xiàn),CCl4誘導(dǎo)的肝組織和體外TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細胞活化中p-ERK,p-AKT的表達水平,DNA甲基化抑制劑和DNM