殼寡糖減輕幽門螺桿菌對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用.pdf

1、研究目的：
　　觀察殼寡糖（Chitooligosaccharide，COS）體外抑制幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)增殖的活性，觀察殼寡糖對(duì)AGS細(xì)胞和HP感染的AGS細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡的作用，探討殼寡糖在治療HP感染及治療胃癌中的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.培養(yǎng)HP菌株并傳代。37℃微需氧環(huán)境中培養(yǎng)48h后，向BHI培養(yǎng)基表面滴加100uL COS溶液，對(duì)照組不做處理，繼續(xù)培養(yǎng)48

2、h，肉眼及顯微鏡下觀察兩組HP菌落形成情況。制備含殼寡糖培養(yǎng)基，HP傳代培養(yǎng)48h，觀察細(xì)菌菌落狀態(tài)。2.觀察殼寡糖減輕HP對(duì)AGS細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用：
　　細(xì)胞共分2組進(jìn)行：AGS細(xì)胞組和HP感染的AGS細(xì)胞。按照感染復(fù)數(shù)MOI=200建立HP感染AGS細(xì)胞的模型。
　　分別向兩組細(xì)胞中分別加入按比例0.5:100、1:100、2:100、4:100稀釋的COS原液，37℃,5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后固定細(xì)胞，

3、10ug/ml Hoechst33258工作液染色，熒光顯微鏡下觀察AGS細(xì)胞的凋亡情況和細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)改變。
　　3.向AGS細(xì)胞中加入按比例稀釋的殼寡糖與100mol/ L，200mol/ L,300mol/ L和400mol/ LBiCl3混合溶液，37℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后固定細(xì)胞，Hoechst33258染色，熒光顯微鏡下觀察AGS細(xì)胞的凋亡情況和細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)改變。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　

4、1.肉眼觀，對(duì)照組細(xì)菌形成良好的無(wú)色透明的菌落形成，布滿培養(yǎng)皿表面的接種區(qū)域，加入殼寡糖的區(qū)域細(xì)菌菌落明顯稀少，散在分布；顯微鏡下觀察，與未加殼寡糖的區(qū)域相比，加入殼寡糖區(qū)域內(nèi)的菌落明顯稀少。
　　2.我們通過Hoechst33258染色熒光染色觀察AGS細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示：（1）AGS細(xì)胞組：與對(duì)照組相比，隨著殼寡糖濃度的增加，細(xì)胞核呈均勻藍(lán)色的細(xì)胞比例明顯降低，而呈亮藍(lán)色顆粒塊狀熒光及核形態(tài)異常的細(xì)胞比例明顯上升，表明殼寡

5、糖具有誘導(dǎo)AGS細(xì)胞凋亡的作用，其強(qiáng)度具有濃度依賴性。（2）感染HP的AGS組：HP感染的AGS細(xì)胞存在一定的凋亡現(xiàn)象，與其相比，加入低濃度的殼寡糖亮藍(lán)色顆粒塊狀熒光及核形態(tài)異常的細(xì)胞比例下降，繼續(xù)增加殼寡糖濃度，亮藍(lán)色熒光的比例上升，這表明在較低的濃度殼寡糖減弱HP對(duì)AGS細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。（3）觀察Bi3+與殼寡糖聯(lián)合對(duì)AGS細(xì)胞凋亡的影響，我們發(fā)現(xiàn)Bi3+與殼寡糖聯(lián)合，其高亮染色的比例比單獨(dú)使用殼寡糖或的比例更高，即二者聯(lián)合比殼