電化學免疫傳感器快速檢測甲型流感病毒的研究.pdf

1、流感病毒長期威脅人類健康，其中甲型流感病毒每年都會出現(xiàn)并不斷變異，有時甚至會導致流感疫情大規(guī)模爆發(fā)流行，而防控的關鍵環(huán)節(jié)之一便是通過檢測病原體對流感疑似病例的快速篩查和診斷?，F(xiàn)有的病毒分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法以及熒光定量PCR等檢測方法在疫情檢測中發(fā)揮了重要作用，但在時效性、靈敏度和操作簡便性方面仍存在不足，不能滿足病原體現(xiàn)場快速檢測的需求。
　　針對上述需求，本論文以A/Beijing/501/2009甲型H1N1

2、流感病毒為檢測對象，于一次性絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)上構建了甲型H1N1流感病毒電化學免疫生物傳感器(EIS)，探索了流感病毒的電化學免疫傳感分析檢測的相關機制，建立了甲型H1N1流感病毒電化學免疫生物傳感檢測技術和方法，主要研究結果如下:
　　(1)對實驗研究所需的材料，如流感病毒和相應的單克隆抗體和HRP標記抗體進行了培養(yǎng)和收集，并對這些材料進行了驗證。用WHO推薦引物經(jīng)RT-PCR驗證以及流感病毒AB分型檢測膠體金試紙條檢

3、測，結果表明培養(yǎng)的A/Beijing/501/2009(H1N1)雞胚尿囊液確屬甲型H1N1型流感病毒，血凝實驗測定其病毒滴度為128HA Unit，證明所培養(yǎng)的A/Beijing/501/2009(H1N1)雞胚尿囊液可以用于后續(xù)的實驗研究。同時還通過ELISA實驗考察了所收集到的單克隆抗體A1-24和HRP標記單抗A1-6-HRP分別與甲型H1N1型流感病毒的親和力，結果表明這兩種抗體材料能與甲型H1N1流感病毒形成親和力較高的免疫

4、夾心復合物，該模式可以用于構建甲型H1N1流感病毒電化學免疫傳感器。
　　(2)考察比較了由不同修飾材料和方法修飾電極的電化學特點，發(fā)現(xiàn)捕獲抗體經(jīng)物理吸附法固定修飾電極后具有較高的信號/本底值比、操作步驟簡單且不需要使用價格昂貴的納米材料或其他化學修飾材料，成本低廉，故最終選擇此方法作為捕獲抗體修飾固定電極的方法，并以此構建甲型H1N1流感病毒電化學免疫傳感器。通過循環(huán)伏安法對該型免疫傳感器的電化學行為進行了表征，結果表明該傳感器

5、表面的電活性物質主要通過擴散傳質方式產(chǎn)生電信號，在傳感器上產(chǎn)生的電流響應信號與電極上加入的被測抗原的濃度呈正比關系，適用于對被測抗原進行定量測定。
　　(3)優(yōu)化了影響傳感器檢測性能的主要工作條件:檢測中捕獲抗體H1-24和檢測抗體A1-6-HRP的濃度分別采用400μg/ml和80μg/ml，在此濃度條件下檢測信號都比較強，均能達到最大信號值的80％以上，能夠實現(xiàn)對A(H1N1)流感病毒的靈敏檢測。孵育最佳溫度均為37℃，在此溫

6、度下抗原抗體反應的活性最高，反應能快速達到平衡狀態(tài)，有利于提高反應效率?？乖皺z測抗體的最佳孵育時間分別為45min和30min，在以上孵育時間條件下，檢測的靈敏度均較高，經(jīng)過優(yōu)化后該免疫傳感器的檢出時間縮短至2h以內，比傳統(tǒng)的ELISA法整體測定時間減少了1～2h，利用這種新型傳感器能夠實現(xiàn)對A(H1N1)流感病毒的快速檢測。
　　(4)建立了電化學免疫傳感器測定甲型H1N1流感病毒的標準曲線，以及測定甲型H1N1流感病毒相應的

7、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)標準曲線和熒光定量法(qPCR)標準曲線，用于對傳感器各項檢測性能指標進行考察。針對A(H1N1)流感病毒的檢測信號與針對甲型H7N9、H3N2、B型流感病毒、EV71以及腺病毒等陰性對照的信號的統(tǒng)計分析檢驗結果表明，該傳感器的特異性良好。重復性測定結果顯示該傳感器的RSD＜10％，回收率為80％～110％，呈現(xiàn)出較高的準確度和精密度。穩(wěn)定性實驗結果顯示該傳感器儲存10天內檢測信號幾乎不下降，30天后的測定值

8、也能保持在85％以上，具有較好的存儲穩(wěn)定性。EIS法的檢測下限可達0.41 HA Unit，與ELISA法相當，并能對4～64HA Unit范圍內的甲型H1N1流感病毒實現(xiàn)定量測定，且EIS的總體假陽性率為10.0％，優(yōu)于ELISA法。所建立的EIS法與qPCR的測定結果的相關系數(shù)為0.9517，說明EIS法定量的準確度能達到與qPCR一致的水平。
　　(5)最后應用微型化的Emstat電化學檢測設備，基于便攜的陣列化電極以甲型H