RhoA在模擬缺血再灌注誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：觀察模擬缺血再灌注對腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響；觀察RhoA和GTP-RhoA在模擬缺血再灌注時(shí)的變化規(guī)律；觀察RhoA的特異性抑制劑(C3轉(zhuǎn)移酶)對GTP-RhoA和細(xì)胞凋亡的影響：研究RhoA在模擬缺血再灌注誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用。 方法：體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)，建立模擬缺血再灌注模型。HK-2細(xì)胞共分為四組：正常對照組(C組)、單純模擬缺血組(Ⅰ組)、模擬缺血再灌注組(I/R組)、C3轉(zhuǎn)移酶

2、預(yù)處理組(C3組)，其中C3轉(zhuǎn)移酶預(yù)處理組又分為低劑量組(C3L,0.02μg/ml)、中劑量組(C3M,0.20μg/ml)和高劑量組(C3H,2.00μg/ml)。Hoechst 33258染色法觀察模擬缺血再灌注時(shí)HK-2細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變；流式細(xì)胞儀檢測模擬缺血再灌注時(shí)HK-2細(xì)胞的凋亡率；Westernblotting法檢測模擬缺血再灌注時(shí)RhoA的表達(dá)；GST RBD親和沉淀法檢測模擬缺血再灌注時(shí)GTP-RhoA的水平。

3、 結(jié)果：正常HK-2細(xì)胞少量表達(dá)RhoA，在模擬缺血1h至再灌注24h過程中，RhoA的表達(dá)基本不變。GTP-RhoA在復(fù)灌30min顯著增加，然后隨再灌注時(shí)間的延長逐漸下降，在復(fù)灌6h又達(dá)到高峰，此時(shí)GTP-RhoA的峰值高于復(fù)灌30min時(shí)的峰值。模擬缺血1h再灌注12h、24h、48h和72h時(shí)，用Hoechst 33258染色法均觀察到凋亡細(xì)胞核的變化，用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)上述I/R不同時(shí)間段HK-2細(xì)胞的凋亡率均增加，以再