雷竹PvPin1At基因克隆和功能分析.pdf

1、Pin1(peptidyl-prolyl cis/trans isomerase,PPIase)是肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶。Pin1對(duì)植物成花轉(zhuǎn)變和人類癌癥等疾病具有調(diào)控作用。在對(duì)擬南芥 Pin1同源基因Pin1At研究中發(fā)現(xiàn),Pin1At基因具有調(diào)控開(kāi)花時(shí)間的作用。擬南芥中Pin1At蛋白是通過(guò)促進(jìn) SOC1和 AGL24兩個(gè) MADS-domain轉(zhuǎn)錄因子中磷酸化的Ser/Thr-Pro基團(tuán)順?lè)串悩?gòu)來(lái)調(diào)控成花轉(zhuǎn)變,從而調(diào)控植物開(kāi)花時(shí)間。

2、本實(shí)驗(yàn)希望通過(guò)對(duì)雷竹(Phyllostachys violascens)Pin1At同源基因的克隆和功能分析,進(jìn)一步了解竹類植物開(kāi)花機(jī)理,為竹類植物開(kāi)花研究奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)根據(jù)玉米、水稻、以及雷竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)引物,以雷竹(Phyllostachys violascens)為材料,利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends, RACE),獲得 PvPin1At c

3、DNA全長(zhǎng)756bp序列。用高保真酶擴(kuò)增雷竹PvPin1At ORF區(qū),得到2條PvPin1At序列,命名為PvPin1At1和PvPin1At2,它們的開(kāi)放閱讀框都為369bp,編碼122個(gè)氨基酸。其中,PvPin1At1第59個(gè)氨基酸為絲氨酸,PvPin1At2在第59個(gè)氨基酸為甘氨酸。對(duì)PvPin1At基因分析和研究,得出以下結(jié)果:
　　(1)通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)PvPin1At基因在植物中相當(dāng)保守,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明PvPin

4、1At基因與禾本科植物二穗短柄草、水稻等聚為一類。
　　(2)對(duì)處在開(kāi)花期雷竹做熒光定量PCR分析,發(fā)現(xiàn)該基因在嫩葉中表達(dá)量最高,其次是莖和鞭,在花芽、老葉、筍中表達(dá)量低。對(duì)不同時(shí)期的雷竹(開(kāi)花前四周到開(kāi)花),做熒光定量PCR分析,發(fā)現(xiàn) PvPin1At基因在開(kāi)花前表達(dá)量逐漸升高,當(dāng)達(dá)到一定閾值后表達(dá)量逐漸下降。
　　(3)通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),證明雷竹中PvPin1At蛋白與PvSOC1蛋白不能相互作用。
　　(4)P

5、vPin1At基因轉(zhuǎn)入擬南芥功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),35S::PvPin1At1轉(zhuǎn)基因擬南芥比野生型擬南芥早開(kāi)花6-7d,而35S::PvPin1At2轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥表型差異不明顯,說(shuō)明PvPin1At1基因中的第59位絲氨酸可能對(duì)雷竹開(kāi)花調(diào)控有重要作用。
　　(5)為了研究PvPin1At蛋白的晶體結(jié)構(gòu),我們構(gòu)建了原核表達(dá)載體,獲得可溶目的大小為31kDa左右的PvPin1At蛋白。
　　(6)因?yàn)槿祟怭in1基因的第7