骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分化潛能的研究.pdf

1、研究背景:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mescnchymal stem cells,MSCs)作為骨髓中一類非造血類干細(xì)胞,具有自我更新和多向分化潛能,最近發(fā)現(xiàn)還具有低免疫原性的特點(diǎn),因此受到臨床醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。目前,MSCs已被廣泛應(yīng)用于研究和治療各種缺血或損傷性疾病以及器官移植抗免疫排斥反應(yīng)等,并取得了初步效果,干細(xì)胞替代治療有望成為臨床上一種新的治療手段。
　　乳腺癌術(shù)后患側(cè)上肢淋巴水腫是一種慢性進(jìn)行性疾病,主要原因是由于在腋

2、窩淋巴結(jié)切除或前哨淋巴結(jié)活檢中損傷了引流上肢的淋巴管,導(dǎo)致淋巴回流不暢,淋巴液淤積于皮下,病情晚期上肢腫脹,功能喪失,給患者造成巨大的痛苦,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。治療上目前以保守治療為主,但是效果不令人滿意,促進(jìn)淋巴管的再生被認(rèn)為是治療淋巴水腫最直接和有效的方法,本文設(shè)想能不能找到一種方法促進(jìn)淋巴管生成來治療乳腺癌術(shù)后上肢淋巴水腫。
　　目的:從成人骨髓中分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并在體外分化誘導(dǎo)成淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。檢測分化的淋巴管內(nèi)

3、皮細(xì)胞在體外形成淋巴管的功能。
　　方法:在髂后上棘采集健康成人骨髓,采用直接貼壁法分離成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)擴(kuò)增至第3-4代,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志CD90、CDl05、CDl4、CD34、HLA-DR的表達(dá)率。把細(xì)胞分成兩組,一組用EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)并加入VEGFC-C(156s),另一組只用EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)7天后,在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的

4、特異性標(biāo)志物Podoplanin、VEGFR-2和VEGFR-3,并應(yīng)用RT-PCR檢測相應(yīng)基因的表達(dá)。用細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)分別檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞形成淋巴管的功能。
　　結(jié)果:貼壁培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)上為纖維細(xì)胞樣,細(xì)胞培養(yǎng)純化三代后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞的CD90、CDl05的表達(dá)率分別為90.03%和97.86%,而CDl4、CD34、HLA-DR的陽性率分別為2.00%、2.18%和1.56%。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)EGM-2和

5、VEGF-C(156s)誘導(dǎo)刺激后,分離純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈鵝卵石樣外觀,Podoplanin、VEGFR-2和VEGFR-3的表達(dá)率分別為26.53%、2.53%和8.55%,而對照組Podoplanin、VEGFR-2和VEGFR-3的表達(dá)率分別為2.84%、1.61%和2.3%,兩組相比Podoplanin和VEGFR-3具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜O.01),兩組間VEGFR-2無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。RT-PCR結(jié)果,試驗(yàn)組

6、可見podoplanin和vegfr-3特異性的條帶,未見vegfr-2的特異性條帶,對照組只顯示了模糊的podoplanin,而未見vegfr-2和vegfr-3的特異性條帶。細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)顯示誘導(dǎo)后的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞具有初步形成管狀結(jié)構(gòu)的功能。
　　結(jié)論:
　　1.成功從成人骨髓中分離培養(yǎng)出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2.分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基EGM-2和VEGF-C(156s)的誘導(dǎo)下,可分化為淋巴管