模擬缺血再灌注后大鼠皮層神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
　　第一部分
　　目的:建立大鼠皮層神經(jīng)元體外模擬缺血再灌注模型,探討體外模擬缺血再灌注后大鼠皮層神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的機(jī)制,及線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑之間的關(guān)系。
　　方法:體外培養(yǎng)SD乳鼠皮層神經(jīng)元,免疫熒光染色鑒定神經(jīng)元純度;透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV、PI雙標(biāo)檢測凋亡率及活性半胱天冬酶(Caspase)-3,-7,-9表達(dá);Western-blot免疫印

2、跡分析Caspase-12,葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein78,GRP78),細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyt c)蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:SD乳鼠皮層神經(jīng)元可純化體外培養(yǎng),建立體外模擬缺血再灌注模型。實驗發(fā)現(xiàn)體外模擬缺血再灌注損傷后,培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元Cyt c、GRP78免疫活性明顯增加,而對照組只有很少表達(dá)。同時Annexin V-FITC和PI聯(lián)合染色FCM檢測缺血再灌注

3、后神經(jīng)元凋亡發(fā)生率顯著高于對照組,并隨再灌注時間延長而增加。流式分析、免疫印跡分析顯示Caspase-3、Caspase-9、Caspase-12均參與了缺血再灌注后的神經(jīng)元凋亡,未檢測到足量活性caspase-7。透射電鏡提示神經(jīng)元缺血再灌注損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體腔腫脹、變形,神經(jīng)元呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)論:神經(jīng)元可體外純化培養(yǎng),為后面的實驗奠定了基礎(chǔ)。形態(tài)學(xué)及生化特征均表明體外模擬缺血再灌注后神經(jīng)元發(fā)生凋亡,caspa

4、se-12、caspase-3及caspase-9參與神經(jīng)元缺血后凋亡,線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑存在相互聯(lián)系。
　　第二部分
　　目的:探討過表達(dá)Bcl-2對體外模擬缺血再灌注后大鼠皮層神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡的影響。
　　方法:體外培養(yǎng)SD乳鼠皮層神經(jīng)元,免疫熒光染色鑒定神經(jīng)元純度。質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染;亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析;AnnexinV、PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率及FITC標(biāo)記活性Caspase-3,-7,-9表達(dá);West

5、ern-blot免疫印跡分析Caspase-12,GRP78,B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因((B-cell lymphoma/leukemia-2 gene,Bcl-2),Cyt c蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:SD乳鼠皮層神經(jīng)元可純化體外培養(yǎng)。皮層神經(jīng)元體外模擬缺血再灌注后(缺血6h再灌注24h)GRP78、Caspase-3、caspase-9、caspase-12蛋白水平增加并可被過表達(dá)Bcl-2抑制(P<0.05),Bcl-2基因

6、轉(zhuǎn)染后Cyt c釋放較未轉(zhuǎn)染組減少(P<0.05),神經(jīng)元缺血6h再灌注24h細(xì)胞凋亡率為17.95％±1.31;Bcl-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后降至8.76%±1.09;各組與實驗組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:外源性Bcl-2也存在亞細(xì)胞分布,過表達(dá)Bcl-2可抑制胞漿細(xì)胞色素c釋放,減少活性caspase-3、caspase-9、caspase-12表達(dá),降低GRP78免疫活性,提示Bcl-2對神經(jīng)元凋亡的抑制作用是通過

7、保護(hù)線粒體功能實現(xiàn)的。
　　第三部分
　　目的:探討siRNA沉默細(xì)胞色素C基因?qū)w外模擬缺血再灌注后大鼠皮層神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡影響。
　　方法:體外培養(yǎng)SD乳鼠皮層神經(jīng)元,免疫熒光染色鑒定神經(jīng)元純度;RNA干擾;亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析;流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV、PI雙標(biāo)檢測凋亡率及活性caspase-3、caspase-7、caspase-9表達(dá);Western-blot免疫印跡分析亞細(xì)胞成分活性caspase-12、G

8、RP78、Bcl-2、cyt c蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:SD乳鼠皮層神經(jīng)元可純化體外培養(yǎng)。培養(yǎng)神經(jīng)元缺血6h再灌注24h細(xì)胞凋亡率為17.95%±2.09;Cyt c siRNA轉(zhuǎn)染后凋亡率降至10.26%±1.37,兩組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。體外模擬缺血再灌注誘導(dǎo)神經(jīng)元GRP78表達(dá)上調(diào),使Cyt c表達(dá)增加,Bcl-2表達(dá)減少。活性caspase-3、caspase-9、caspase-12表達(dá)增加。siRNA Cy

9、t c基因靜默促進(jìn)細(xì)胞Bcl-2表達(dá),降低GRP78、活性caspase-12免疫活性,減少活化的caspase-3、caspase-9含量。
　　結(jié)論:細(xì)胞色素c釋放是多種凋亡途徑的關(guān)鍵。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制胞漿cyt c釋放,不僅減少了活性caspase-3和caspase-9的表達(dá),也降低了特異性位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的caspase-12的免疫活性,同時增加了線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分的 Bcl-2蛋白表達(dá),提示抑制cyt c釋放即可以保護(hù)