基于DNA微陣列的甲基化定量檢測方法研究.pdf

1、DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳現(xiàn)象，在細(xì)胞分化、發(fā)育及增殖過程中起著十分重要的作用。近來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中基因組總體甲基化水平的降低和某些基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生過甲基化是腫瘤最早，也是最常見的分子改變之一。異常DNA甲基化與腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄失活密切相關(guān)，這種現(xiàn)象在腫瘤中非常普遍。因此，異常DNA甲基化的檢測可以作為腫瘤診斷和預(yù)后的一個(gè)有用的分子標(biāo)記。近年來相關(guān)的研究方法發(fā)展迅速，而基因芯片/微陣列的出現(xiàn)為DNA甲基化的高通量檢測提供了強(qiáng)

2、有力的技術(shù)平臺。本文基于微陣列的思路，發(fā)展了兩種DNA甲基化定量分析的方法： 1．基于微陣列的E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化定量分析DNA甲基化的定量分析對于腫瘤的早期診斷和預(yù)后分析十分重要，而E-cadherin基因是一重要的抑癌基因，在多種腫瘤發(fā)生過程中表達(dá)下調(diào)，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)其表達(dá)抑制與其啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化密切相關(guān)?；谏镄酒夹g(shù)發(fā)展了對該基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化定量分析的方法。靶序列來自5例正常人外周血與1

3、5例白血病樣本，經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后，甲基化的胞嘧啶保持不變，而未甲基化的胞嘧啶在PCR擴(kuò)增后則轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?。根?jù)這種變化，設(shè)計(jì)了5組寡聚核苷酸探針。然后，利用完全甲基化的陽性克隆與非甲基化的陰性克隆制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過比對來判斷樣本中’E-cadherin基因的甲基化狀態(tài)，微陣列結(jié)果通過MSP和克隆測序得以驗(yàn)證。結(jié)果表明，該微陣列能很好地檢測樣品中E-cadherin基因的甲基化狀態(tài)。所有樣本均發(fā)生了一定程度的甲基化，一半以上的樣本甲基

4、化程度在50％以上，并且發(fā)現(xiàn)了潛在的甲基化熱點(diǎn)位置。因此，該微陣列能很好地應(yīng)用于樣本眾多個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化檢測，相對MSP而言，該方法能更全面的獲得特定片斷內(nèi)的甲基化信息，相比克隆測序而言，則具備快速敏感的優(yōu)勢。 2．基于在膜原位亞硫酸氫鹽翻轉(zhuǎn)的多樣本甲基化定量分析多樣本的甲基化定量分析一直是甲基化研究中的難點(diǎn)，而對多個(gè)樣本逐一進(jìn)行必要的亞硫酸氫鹽翻轉(zhuǎn)處理則增加了實(shí)驗(yàn)的操作難度。在此，開發(fā)了一種新方法，即在尼龍膜上固定樣本后直

5、接在膜原位亞硫酸氫鹽處理，然后與標(biāo)記地高辛的特異性探針雜交，通過化學(xué)發(fā)光的方法獲取雜交信號，構(gòu)建陽性與陰性參照建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后，即可應(yīng)用于后續(xù)的甲基化定量分析，獲取多樣本的甲基化信息。作為嘗試性實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)中所用樣本為puC19質(zhì)粒DNA，在甲基化酶處理出不同甲基化模式后點(diǎn)于膜上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)成功檢測并實(shí)現(xiàn)了定量化，表明該方法在不依賴液相亞硫酸氫鹽處理和PCR擴(kuò)增的情況下，能夠簡單有效地進(jìn)行CpG位點(diǎn)的甲基化定量分析，并完全能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模