血清4型Ⅰ群禽腺病毒的分離鑒定及流行病學(xué)調(diào)查.pdf

1、心包積水-肝炎綜合征（Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS）是由血清4型Ⅰ群禽腺病毒（Fowl Adenovirus serotype4，F(xiàn)AV4）引起的一種國內(nèi)新發(fā)家禽傳染性疾病。該病一經(jīng)發(fā)生，便迅速向周圍地區(qū)蔓延，迄今在我國多個(gè)省市均有該病的報(bào)道，目前已確定該病毒可以感染多個(gè)品種的雞和鴨?；疾〖仪葜饕憩F(xiàn)為無明顯先兆而突然倒地死亡，發(fā)病家禽多見于3~5周齡的商品家禽，種雞和種鴨也可以感染。其

2、特征性癥狀為3~5周齡的肉雞突然死亡，剖檢主要變化為心包積水和出血性肝炎。該病感染率可高達(dá)90％以上，死亡率在20%~75%，最高可達(dá)80%，嚴(yán)重危害著我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。本研究從疑似患病的商品肉雞肝臟組織中分離到FAV4，并對其進(jìn)行生物學(xué)特性作了研究，對分離到的病毒進(jìn)行鑒定，以及對山東地區(qū)血清4型Ⅰ群禽腺病毒的臨床感染情況檢測及結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，旨在為今后更好的闡明FAV4的流行規(guī)律以及防制提供理論依據(jù)。
　　1、血清4型Ⅰ群禽腺

3、病毒的分離鑒定
　　本研究采用雞胚卵黃囊方式接種的方法從山東某地區(qū)以心包積液為主要特征的疑似FAV4感染的商品雞肝臟組織中分離到病毒，并對分離的毒株進(jìn)行PCR擴(kuò)增、血凝試驗(yàn)、ELD50測定、Hexon基因序列測定與分析以及對人工感染試驗(yàn)進(jìn)行組織病理學(xué)觀察、抗體水平檢測等一系列試驗(yàn)。結(jié)果顯示，分離的毒株不能凝集雞和鴨的紅細(xì)胞，但能夠凝集大鼠的紅細(xì)胞；ELD50為10-3.33/0.2 mL。組織學(xué)變化顯示肝細(xì)胞纖維化和脂肪變性，腎小

4、管上皮細(xì)胞腫脹，心肌纖維斷裂、顆粒變性。對臨床采集的血清檢測結(jié)果顯示發(fā)病雞群抗體水平為陽性，發(fā)病雞群中的健康雞陽性率為40%（40/100），表明雞群中存在隱性感染。將分離株的Hexon基因組與已發(fā)表的血清4型Ⅰ群禽腺病毒基因進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該分離株與印度株在同一個(gè)分支上，同源性在99.6%以上，而與韓國、歐洲、美洲株同源性較遠(yuǎn)。用分離的毒株感染10日齡的雛雞能引起心包積液、肝臟出血、腎臟腫大等病變。上述結(jié)果表明該分離株為血清4型I

5、群禽腺病毒。
　　2、血清4型Ⅰ群禽腺病毒Taqman熒光定量PCR方法的建立
　　本試驗(yàn)針對Genbank上已發(fā)表的Ⅰ群禽腺病毒的12個(gè)血清型的Hexon基因，建立了特異性檢測血清4型Ⅰ群禽腺病毒的Taqman熒光定量PCR方法。將PCR擴(kuò)增的片段連接到pMD18-T載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)序列分析正確后，測定重組質(zhì)粒濃度，將標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋后用于構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行反應(yīng)的靈敏性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)

6、果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct值與模板濃度呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.1077x+38.305，相關(guān)系數(shù)R2為0.9951，此方法可以檢測出最低量為40 copies，靈敏性是普通PCR的100倍；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)CV均小于0.40%，批間變異系數(shù)CV均小于0.65%；對臨床采集的679份疑似感染FAV4的病料檢測表明，Taqman熒光定量PCR和普通PCR檢測陽性率分別為76.29%和65.24%，兩者符合率為84.

7、71%。用該方法檢測Ⅰ群禽腺病毒的其他11個(gè)血清型病毒，結(jié)果均為陰性，無交叉反應(yīng)。研究結(jié)果表明，該方法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，可應(yīng)用于FAV4的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
　　3、山東地區(qū)血清4型Ⅰ群禽腺病毒的流行病學(xué)調(diào)查
　　對山東地區(qū)養(yǎng)殖場采集的679份病料進(jìn)行檢測，共檢測出FAV4陽性樣品443份，陽性率為65.2%；其中商品雞的檢出率為71.9%，蛋（種）雞的檢出率為34.2%，商品雞的檢出率明顯的高于種雞的檢出

8、率，表明該病毒主要感染商品雞；而蛋（種）鴨的檢出率為68.6%，與商品鴨的檢出率（79.2%）相差不大，但蛋（種）鴨的檢出率明顯的高于種雞的檢出率。對臨床采集的172份種雞病料進(jìn)行H9N2、CIAV和IBDV等免疫抑制性病原的檢測，H9N2和CIAV的檢出率較高，感染率在30%左右。FAV4與H9N2和CIAV的混合感染比率相對較高，表明家禽發(fā)生免疫抑制性疾病時(shí)能夠促進(jìn) FAV4的發(fā)生。而對149份商品雞樣品進(jìn)行H9N2、CIAV和IB

9、DV等免疫抑制性病原的檢測，商品肉雞感染FAV4與H9N2和IBDV的感染呈一定的相關(guān)性。對358份鴨源樣品進(jìn)行檢測，F(xiàn)AV4陽性率為77.1%，其中蛋（種）鴨的FAV4陽性率為68.6%，商品鴨的FAV4陽性率為79.2%。對檢測出FAV4的276份樣品進(jìn)行H9N2和IBDV的檢測，48份陽性蛋（種）鴨樣本中H9N2檢測出20份，陽性率為41.67%，228份陽性商品鴨樣本中H9N2檢測出88份，IBDV檢測出61份。蛋（種）鴨同時(shí)感