卵泡抑素相關蛋白抑制血管內皮細胞凋亡的機制研究.pdf

1、一、研究背景與目的
　　血管內皮細胞(VEC)是循環(huán)血液與血管平滑肌間的機械屏障。VEC的功能相當廣泛,除起轉運屏障作用外,還具有分泌功能，可以合成分泌多種物質,對調節(jié)血管緊張度、血液流通、細胞生成、炎癥反應、免疫等功能具有重要作用。多種因素可通過不同機制與途徑損傷血管內皮細胞，使內皮屏障作用減弱，血中脂蛋白過多地進入動脈壁沉積下來，被清道夫細胞吞噬形成泡沫細胞；內皮細胞受損后，炎細胞、血小板的粘附與內容物的釋放又加重了內皮細胞損

2、傷，從而逐漸形成粥樣硬化斑塊，因此尋找一種應用方便、專一性強、來源豐富、效果良好的VEC保護劑也越來越引起人們的重視。
　　本課題以血管內皮細胞為靶細胞，以卵泡抑素相關蛋白（FRP）為主要研究對象，以Western Blot、Si-RNA、Rt-PCR、ChIP assay等實驗技術為研究手段，重點探討FRP對VEC的保護作用，力求闡明該蛋白對VEC的抗凋亡機制及其在動脈粥樣硬化中的病理意義。
　　二、材料與方法
　　

3、1、根據驗證樣性的基因編碼序列獲得FRP編碼區(qū)cDNA連接于表達載體pET32a，構建表達重組子，轉化入 Origami（DE3），1mM IPTG誘導蛋白表達，使用Ni-NTA His Band Resins，Sephacryl S-100純化蛋白，腸激酶酶切融合蛋白并鑒定。
　　2、分離臍帶靜脈血管內皮細胞，并用含有胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，每2-3天換液一次，定期進行消化傳代。
　　3、將C段帶有FLA

4、G標簽的FRP基因片段連接到pcDNA4/TO上，先后將pcDNA6/TR和pcDNA4/TO/FRP-FLAG轉染至內皮細胞系EAHY926中，用blasticidin和zeocin篩選穩(wěn)定轉染的單克隆細胞。
　　4、制備ApoE基因敲除小鼠為背景的FRP轉基因動物，ApoE基因缺陷小鼠與ApoE基因缺陷FRP轉基因小鼠，構建動脈粥樣硬化動物模型。
　　5、通過PI-Annexin-V雙染后流式細胞儀分析，研究FRP重組蛋

5、白FRP抗ox-LDL誘導的細胞凋亡維持HUVEC的細胞活性。
　　6、通過rt-PCR WesternBlot等方法檢測FRP下游抗凋亡蛋白。
　　三、結果
　　1.給予ApoE缺失小鼠及ApoE基因缺陷-FRP轉基因小鼠喂養(yǎng)12周。TUNEL提示ApoE缺失小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成后血管內皮細胞凋亡增加；ApoE基因缺陷-FRP轉基因小鼠TUNEL染色顯示凋亡的內皮細胞顯著少于ApoE組。用oxLDL的終濃度依次為

6、0ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml、50ug/ml（0ug/ml oxLDL作為對照組）處理HUVECs直接影響FRP的表達，結果發(fā)現(xiàn)處理后HUVECs的FRP表達量與oxLDL的濃度呈反比。
　　2.細菌可溶性的蛋白經Ni-His band及Sephadex Sephacryl S-100純化酶切蛋白后，得到目的蛋白。
　　3.用濃度為50ug/ml的ox-LDL處理HUVECs，與對照組相比細胞

7、變圓，貼壁細胞減少。100ng/ml的FRP重組蛋白可以抗ox-LDL誘導的細胞凋亡。MTT檢測提示，隨著ox-LDL濃度的增加，內皮細胞的存活能力逐漸降低；不同濃度的FRP和ox-LDL對內皮細胞進行處理時，發(fā)現(xiàn)FRP可以抵抗ox-LDL誘導的內皮細胞凋亡，當FRP濃度為100ng/ml時有顯著性差異。FRP濃度大于80ng/ml時可顯著提高細胞活性。FACS提示FRP可顯著降低凋亡早期annexin V陽性細胞數(shù)。
　　4.按

8、如下方法處理細胞24小時：1、空白對照組+50μg/ml LDL.2、+50μg/ml oxLDL.3、+50μg/ml oxLDL+50ng/ml FRP.4、+50μg/ml oxLDL+75ng/ml FRP.5、+50μg/ml oxLDL+100ng/ml FRP。實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RP可以上調磷酸化Akt的表達，從而激活磷酸化Akt的下游基因——磷酸化Bad的表達。然而，Akt的表達量并未隨著FRP的表達量而改變，Bcl2的表達量

9、隨著FRP濃度的增高而顯著性增加。
　　5.利用轉染Bcl2 siRNA的方法抑制Bcl2的蛋白表達，可使Bcl2蛋白表達量降低約50％（Scramble RNA組為對照組）。用FRP誘導Bcl2表達發(fā)現(xiàn)Bcl2 siRNA組與對照組相比Bcl2的表達量無明顯增加。在Scramble RNA組中可以觀察到FRP對ox-LDL誘導的HUVEC凋亡仍有保護作用，而在Bcl2 siRNA組，F(xiàn)RP的保護作用喪失。
　　四、結論