核黃素受體蛋白對(duì)植物開花轉(zhuǎn)型和抗病防衛(wèi)調(diào)控作用的初步研究.pdf

1、核黃素在生物體內(nèi)以黃素單核苷酸FMN及黃素腺嘌呤二核苷酸FAD的形式作為黃素酶的輔酶，參與機(jī)體組織呼吸鏈電子傳遞及氧化還原反應(yīng)。核黃素參與植物抗氧化及過氧化過程，從而影響氧化性損傷及后續(xù)過敏反應(yīng)過程中活性氧中間體(reactive oxygen intermediates，ROIs)的產(chǎn)生。ROIs是過敏細(xì)胞壞死的重要信號(hào)，能調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、抗病、抗蟲、抗逆，所以核黃素與植物免疫反應(yīng)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，多種植物體外施核黃素后，生長(zhǎng)加快、作物產(chǎn)量提

2、高、抗逆能力增強(qiáng)，并且啟動(dòng)未知的抗病信號(hào)通路而抗病增強(qiáng)。我們假設(shè)植物中內(nèi)源核黃素含量的變化可能影響相關(guān)生理生化過程，進(jìn)而參與了植物的抗病防衛(wèi)和生長(zhǎng)發(fā)育。我們以此為切入點(diǎn)，著手研究核黃素參與調(diào)控植物生長(zhǎng)和防衛(wèi)的機(jī)制及與基本防衛(wèi)通路的交叉對(duì)話。 本實(shí)驗(yàn)室已有整合中華鱉核黃素受體基因(riboflavin receptor protein，RIR)的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。已有研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中導(dǎo)入外源的基因促使內(nèi)源核黃素總含量

3、的升高；與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)加快、個(gè)體較大、開花提前；丁香假單胞番茄致病變種Pseudomonas syringae pv．tomato DC3000在轉(zhuǎn)基因植株上發(fā)病癥狀減輕，細(xì)菌繁殖相對(duì)緩慢。針對(duì)轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)的有益表型，我們展開系列研究，探討核黃素受體影響核黃素含量的機(jī)制及后續(xù)反應(yīng)中相關(guān)基因的表達(dá)特征和基本通路的開啟交叉細(xì)節(jié)。 本文用PCR(polymerase chain reaction)的方法從含有軟體海龜編

4、碼核黃素結(jié)合蛋白(riboflavin receptor protein，RIR)基因的質(zhì)粒中克隆出該基因，將RIR基因與原核表達(dá)載體pET30a(+)重組并進(jìn)行表達(dá)，聚丙烯酰胺凝膠(SDS)電泳表明蛋白質(zhì)的大小35kD，以BL21(DE3)pLysS作宿主菌，1 mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside)誘導(dǎo)4小時(shí)，融合蛋白His-taggeal RIR表達(dá)量達(dá)最大。體外RIR能與核黃素結(jié)合而淬

5、滅核黃素的自發(fā)熒光，表明RIR具有生物活性。本文研究結(jié)果可為今后研究核黃素受體蛋白調(diào)節(jié)核黃素含量參與植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，研究了轉(zhuǎn)RIR基因株系RIRA18的遺傳背景。RIRA18作為父本，回交統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)F<,2>代以卡那抗性3：1分離，卡那抗性基因?yàn)轱@性，符合孟德爾單基因位點(diǎn)控制的分離規(guī)律；同時(shí)反向PCR策略擴(kuò)增T-DNA插入片段側(cè)翼序列，結(jié)果為單條帶，測(cè)序得到的序列經(jīng)比對(duì)為擬南芥第二染色體18S和

6、25S的一段間隔序列，即為轉(zhuǎn)基因單元的插入位點(diǎn)。這兩項(xiàng)結(jié)果表明RIRA18含單轉(zhuǎn)基因拷貝，且RIR的表型并非由插入點(diǎn)基因的破壞而產(chǎn)生。運(yùn)用轉(zhuǎn)基因和人工授粉的方法將轉(zhuǎn)基因單元或RIR位點(diǎn)與基本通路的突變體etr1-1，ein2；aux1-7，jar1-1，abi1-1，npr1-1進(jìn)行整合，在F<,1>、F<,2<代運(yùn)用相應(yīng)平板篩選及分子鑒定、表型輔助判斷等手段鑒定雜交品系單株，為研究核黃素參與調(diào)控植物防衛(wèi)和生長(zhǎng)的交叉點(diǎn)提供基礎(chǔ)材料。

7、 為驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株開花提前，運(yùn)用Real Time相對(duì)定量2<'-△△Ct>策略，比較Col-0和RIRA18從日出0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h各時(shí)間段光周期光受體基因PHYA、PHYB、CRY1、CRY2、中心振蕩器組分TOC、 CCS和下游的SOC、FT的節(jié)律表達(dá)情況。RIRA18中光受體基因和中心振蕩器組分表達(dá)都上調(diào)，效應(yīng)基因SOC、FT的表達(dá)水平不如野生型，而與表型不符。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步的研究提供了