Fra-1與乳腺癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)性的實驗研究.pdf

1、Fra-1是轉(zhuǎn)錄因子AP-1家族中的一員，最近研究發(fā)現(xiàn)Fra-1過表達可促進細胞的運動、侵襲。在鼠成纖維細胞中過表達Fra-1可導(dǎo)致貼壁非依賴性生長以及惡性轉(zhuǎn)化。在多種腫瘤如乳腺、肺、結(jié)腸以及轉(zhuǎn)化的細胞系中檢測到Fra-1 mRNA及蛋白水平的高表達。然而有關(guān)Fra-1在良、惡性乳腺組織中的表達、Fra-1是否增加腫瘤的侵襲和遷移，F(xiàn)ra-1調(diào)控哪些侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因鮮有報道。 本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測Fra-1在良、惡性乳

2、腺腫瘤中的表達差別，發(fā)現(xiàn)良、惡性乳腺腫瘤的細胞核和細胞質(zhì)都存在Fra-1表達，但Fra-1在惡性腫瘤細胞質(zhì)中的表達明顯高于良性腫瘤，提示與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明Fra-1在惡性腫瘤細胞質(zhì)中的表達與乳腺癌預(yù)后指標ER、PR和HER2的表達均無相關(guān)性。RT-PCR及Western Blot分析結(jié)果證實，高侵襲性的乳腺癌細胞中Fra-1 mRNA及蛋白的表達水平增高，低侵襲性的乳腺癌細胞中Fra-1 mRNA和蛋白則低表達或不表

3、達。 隨后，構(gòu)建了Fra-1真核表達載體，在低侵襲性的MCF-7乳腺癌細胞中過表達Fra-1，通過集落形成實驗、黏附實驗、遷移實驗觀察Fra-1對乳腺癌細胞侵襲和遷移的影響。結(jié)果顯示Fra-1可增加乳腺癌細胞的增殖、黏附和遷移能力，RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-1對AP-1部分家族成員有調(diào)控作用。 為進一步研究Fra-1參與腫瘤侵襲遷移的機制，我們構(gòu)建了pGL3-MMP-9啟動子報告載體，分析Fra-1對侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因

4、MMP-9啟動子活性的影響。雙熒光素報告載體分析實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-1對MMP-9的啟動子活性無明顯影響。重新對MMP-9啟動子進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)MMP-9啟動子上AP-1反應(yīng)元件(TRE)與轉(zhuǎn)錄因子Stat3的反應(yīng)元件(SIE)相毗鄰。再次應(yīng)用雙熒光素報告載體分析，發(fā)現(xiàn)Fra-1與Stat3協(xié)同參與了對MMP-9的啟動子的調(diào)控，結(jié)果表明Fra-1協(xié)同Stat3明顯增加了MMP-9的啟動子活性。采用Fra-1、Stat3C共轉(zhuǎn)染后明

5、膠酶譜實驗證實MMP-9的酶活性顯著增高。通過免疫共沉淀實驗證實Stat3與Fra-1/c-Jun存在相互作用；寡核苷酸pull down實驗證實，Stat3、 Fra-1/c-Jun與含TRE和SIE的MMP-9啟動子序列在體外存在直接的相互作用。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合PCR(ChIP-PCR)方法進一步確證，Stat3和Fra-1與含TRE元件及SIE元件的MMP-9啟動子序列的原位結(jié)合。 綜上所述：(1)Fra-1在乳腺惡性