水華藍(lán)藻微囊藻毒素-RR分離純化及急性毒性效應(yīng).pdf

1、一、目的和意義：
　　近年來,國內(nèi)藍(lán)藻水華的爆發(fā)頻度逐年增加。當(dāng)藍(lán)藻死亡后,藻細(xì)胞破裂釋放大量的藻類毒素,其中以微囊藻毒素的存在最為普遍,且與人類健康的關(guān)系最為密切,成為目前研究最多的一類藻類毒素。其毒理學(xué)、免疫學(xué)以及降解和去除等成為研究的熱點,需要大量微囊藻毒素純品。但因其價格昂貴且主要依靠進(jìn)口,成為困擾研究人員進(jìn)一步深入開展上述研究的瓶頸。
　　本文旨在開展微囊藻毒素-RR(MC-RR)純化以及急性毒性的研究,通過選擇與

2、優(yōu)化提取方法、固相萃取、Sephadex LH-20凝膠色譜層析各種參數(shù),獲得純度超過90％的MC-RR。再用純化的MC-RR作為受試物經(jīng)腹腔注射和經(jīng)口兩種不同的途徑,測定LD50值,初步評價MC-RR對機(jī)體的急性毒性效應(yīng)特征、靶器官、劑量-反應(yīng)關(guān)系,為今后自主提取、純化、收獲藻毒素純品提供一套較為成熟的方法,并為其他毒性實驗的劑量設(shè)計和觀察指標(biāo)選擇提供參考依據(jù)。
　　二、方法：
　　1.化學(xué)提取與鑒定以野外采集的藍(lán)藻水華為

3、原料,通過比較反復(fù)凍融、水浴法和70%甲醇細(xì)胞破碎法提取效率,確定70%甲醇提取法為最優(yōu)方法后,對后者提取重復(fù)次數(shù),每次提取時間及提取溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。獲得的粗提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇后,經(jīng)固相萃取初步純化和濃縮,上樣至Sephadex LH-20凝膠層析柱,以甲醇為流動相,用自動部分收集器收集洗脫液,紫外分光光度計測定每管洗脫液在238nm的吸收值。以A238為縱坐標(biāo),以管編號為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。對上樣量,洗脫液流速進(jìn)行優(yōu)化,獲得最

4、優(yōu)洗脫條件。用高效液相色譜對峰值組分進(jìn)行鑒定,并同時利用紫外分光光度計對毒素光譜特征進(jìn)行鑒定。
　　2.生物毒性鑒定采用改進(jìn)寇氏法計算MC-RR經(jīng)腹腔注射小鼠LD50值。根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果,分為400μg/kg、282.84μg/kg、200μg/kg、141.42μg/kg、100μg/kg五個劑量組,對照組為生理鹽水組,每組10只昆明小鼠,雌雄各半。染毒后觀察急性中毒行為表現(xiàn),記錄小鼠死亡數(shù)及死亡時間,并對死亡小鼠及時取心肝腎以

5、計算臟器系數(shù)以及進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。用序貫法測MC-RR經(jīng)口的LD50值,并根據(jù)測定的LD50值染毒,測定小鼠在其開始發(fā)生中毒反應(yīng)時間和平均死亡時間這兩個時點的血清酶學(xué)、肝臟臟器指數(shù)以及病理組織學(xué)的改變。
　　三、結(jié)果：
　　1.用70%的甲醇溶液溶解35g藻漿,經(jīng)離心等系列處理,得粗提液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除甲醇;經(jīng)HLB柱固相萃取后,7.5mL洗脫液含4.92mg MC-RR和0.53mg微囊藻毒素-LR(MC-LR),然后將其

6、濃縮至2mL;再用Sephadex LH-20凝膠過濾層析進(jìn)一步純化,通過測定流出組分在238nm處的吸光度值,確定MC-RR在第一個洗脫峰,最終獲得3.65mg樣品純度超過90%的MC-RR,產(chǎn)品得率為74.1%。其吸收光譜在238nm處有特征吸收。
　　2.小鼠經(jīng)腹腔注射染毒LD50=192.75μg/kg,95%的置信區(qū)間為176.59~206.89μg/kg。400μg/kg、282.84μg/kg、200μg/kg、14

7、1.42μg/kg、100μg/kg五個劑量組小鼠死亡率分別為10/10,9/10,6/10,1/10,0/10。隨著劑量增加,肝臟臟器系數(shù)顯著增加,組織病理學(xué)肝細(xì)胞壞死、肝竇充血逐漸加重。經(jīng)口染毒LD50為12.10mg/kg,95%的置信區(qū)間為10.75~13.45mg/kg。以LD50劑量給小鼠染毒后,約45min后開始有中毒反應(yīng),平均死亡時間為4h。與對照相比,血清中ALT、AST、ALP及LDH的水平在45min時明顯上升,4

8、h后進(jìn)一步上升。肝臟臟器系數(shù)與血清酶學(xué)的變化一致,而心臟和腎臟臟器系數(shù)未見明顯改變。組織病理學(xué)變化顯示染毒45min后,肝細(xì)胞呈點狀壞死和肝臟組織少量充血,4h后肝細(xì)胞大面積壞死,肝竇大面積充血。
　　四、結(jié)論：
　　以野外收集的水華藍(lán)藻為原料,采用75%的甲醇溶液提取,經(jīng)過固相萃取初步濃縮純化后,再通過Sephadex LH-20凝膠層析,獲得純度超過90%的MC-RR。MC-RR具有明顯的肝毒性,在急性毒性中未觀察到腎臟