實(shí)時熒光PCR法檢測飼料中反芻動物源性成分.pdf

1、含有反芻動物源性成分的飼料是瘋牛病、羊癢病的主要傳播途徑，采用實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)對反芻動物源性成分的檢測方法已有很多研究，但使用SYBR Green Ⅰ熒光染料檢測模式的研究尚未見報道。本文旨在建立一種使用SYBR Green Ⅰ熒光染料檢測模式和通用引物，且能快速、簡便、特異且成本低廉的檢測出飼料中反芻動物源性成分的方法，保證進(jìn)口動物源性飼料的安全，防止瘋牛病進(jìn)入我國。

2、 本文通過對牛、山羊、綿羊和鹿四種動物的線粒體細(xì)胞色素b DNA序列的比較，確定了四種反芻動物的共有保守序列，根據(jù)此序列設(shè)計一段通用特異性擴(kuò)增引物。在優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，采用SYBR Green Ⅰ熒光染料檢測模式，使用通用引物和SYBR Premix Ex Taq<'TM>商品試劑盒對四種動物的模板DNA進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，對飼料中的反芻動物源性成分進(jìn)行定性分析，并考察了通過解鏈溫度T<,m>值的差異對檢出的反

3、芻動物種類進(jìn)行區(qū)分的可能性。同時還對此方法的特異性、重復(fù)性、最低檢出限及是否存在引物競爭進(jìn)行了實(shí)驗。 實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后可見，四種反芻動物均有擴(kuò)增，Tm值均有差異。在特異性實(shí)驗中，除四種反芻動物產(chǎn)生擴(kuò)增外，其他常見的可能用于動物源性飼料的動物如魚、雞、豬、狗、兔、馬均沒有產(chǎn)生擴(kuò)增。在重復(fù)性實(shí)驗中，四種反芻動物的解鏈曲線Tm值重復(fù)性很好，牛、山羊、綿羊和鹿的Tm值分別落在區(qū)間82.40±0.026℃、79.95±0.05

4、6℃、81.13±0.063℃和79.50±0.063℃之間，相鄰兩者之間沒有交叉。檢出限實(shí)驗得出此方法的最低檢出限可達(dá)0.001％。引物競爭實(shí)驗中，兩種或兩種以上反芻動物的含量相當(dāng)時，所有動物均可以檢測出，但由于鹿和山羊的Tm值相近，兩者之間的解鏈曲線有重疊現(xiàn)象，難以判斷，混合樣品中含量占優(yōu)勢的成分在擴(kuò)增中占優(yōu)勢。 本文設(shè)計了一段通用特異性擴(kuò)增引物，可同時對四種反芻動物成分進(jìn)行特異性擴(kuò)增。建立了一種采用SYBR Green Ⅰ