以?shī)W沙利鉑、順鉑為主的聯(lián)合用藥誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的:
　　胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,化療是胃癌尤其是進(jìn)展期胃癌綜合治療中必不可少的組成部分。但由于胃癌對(duì)化療藥物有天然耐藥性,研究者開(kāi)展了多方面的研究,以提高藥物的療效,減輕藥物對(duì)正常組織的毒性,如如何科學(xué)合理的聯(lián)合用藥、選擇更優(yōu)化的聯(lián)合方式及給藥途徑,以及靶向治療的研究等,并不斷取得了新的進(jìn)展。鉑類是細(xì)胞周期非特異性抗癌藥物,類似雙功能烷化劑,DNA是其作用靶點(diǎn);在低氯環(huán)境中解離,與DNA等生物大分子結(jié)合形成鏈內(nèi)交

2、聯(lián)、鏈間交聯(lián)、DNA-蛋白質(zhì)分子間交聯(lián),從而使DNA鏈局部紐結(jié)或解旋,阻止DNA聚合酶推進(jìn),致使DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄失敗,造成腫瘤細(xì)胞死亡。自從發(fā)現(xiàn)順鉑具有抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)的活性以來(lái),鉑類藥物在腫瘤化療中的研究與臨床應(yīng)用取得了迅速的進(jìn)展,現(xiàn)已成為目前臨床上不可或缺的一線化療藥物。目前,國(guó)內(nèi)常用的鉑類藥物有順鉑(cisplatin,DDP)、卡鉑(carboplatin,CBP)和奧沙利鉑(oxaliplatin,OXA)。順鉑嚴(yán)重的耳腎毒性

3、使其臨床劑量受到一定限制,從而影響療效,為了開(kāi)發(fā)高效低毒的新型鉑類抗癌藥物,研究者用1,2-二氨基環(huán)己烷(DACH)基團(tuán)替代順鉑(CDDP)NH4的氨基則產(chǎn)生奧沙利鉑。奧沙利鉑作用機(jī)制與順鉑相似,抗腫瘤活性優(yōu)于順鉑,對(duì)耐順鉑的腫瘤細(xì)胞亦有作用。奧沙利鉑主要?jiǎng)┝肯拗菩远拘允峭庵苌窠?jīng)毒性,無(wú)耳腎毒性,與順鉑毒副作用不疊加,值得進(jìn)一步研究探討二者聯(lián)合應(yīng)用以起到增效減毒的臨床療效。目前鉑類藥物聯(lián)合應(yīng)用主要集中在順鉑、卡鉑聯(lián)合治療胃癌、食管癌、肺

4、癌、卵巢癌等;也有報(bào)道順鉑、奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用治療卵巢癌、食管癌、賁門癌、生殖細(xì)胞腫瘤有協(xié)同作用,但涉及到順鉑、奧沙利鉑靜脈聯(lián)合應(yīng)用治療胃癌的臨床和基礎(chǔ)研究很少。DDP、OXA、5-FU是臨床胃癌化療方案中的常用藥物,PF方案是胃癌一線基礎(chǔ)治療方案,但是藥物毒性限制了鉑類臨床大劑量應(yīng)用。本研究以多種實(shí)驗(yàn)方法觀察以DDP、OXA為主聯(lián)合用藥對(duì)胃癌細(xì)胞體外的抑瘤活性和誘導(dǎo)凋亡能力,以及聯(lián)合用藥價(jià)值,為開(kāi)發(fā)高效低毒的臨床化療方案提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依

5、據(jù)。
　　材料與方法:
　　1.細(xì)胞:人胃癌細(xì)胞系BGC-823。
　　2.實(shí)驗(yàn)藥物:奧沙利鉑(oxaliplatin,OXA)、順鉑(cis-dismine dichoroplatinum,DDP)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)。
　　3.MTT比色法測(cè)定不同濃度的單藥及聯(lián)合用藥處理后細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率,并繪制生長(zhǎng)曲線。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的周期分布。
　　5.免疫組

6、化測(cè)定凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示,計(jì)量資料符合正態(tài)性,方差齊時(shí)多組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA),相同處理組前后的比較用配對(duì)t檢驗(yàn);P≤0.05具有顯著性。
　　結(jié)果:
　　1.不同濃度的OXA單藥作用48h后,胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到不同程度的抑制,所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及不同濃度實(shí)驗(yàn)組之間OD值比

7、較有顯著差異(P<0.05)。結(jié)果顯示,OXA單藥可有效抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng),呈劑量依賴性。
　　2.不同濃度的OXA、DDP聯(lián)合用藥作用于胃癌細(xì)胞,所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組之間OD值比較有顯著差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,OXA與DDP聯(lián)合用藥可有效抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng),呈劑量依賴性。OXA聯(lián)合DDP作用胃癌細(xì)胞48h后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率較OXA單藥組增高,OXA的IC50值下降。
　　3.不同濃度的OXA、DDP、5

8、-FU聯(lián)合用藥作用于胃癌細(xì)胞,所有實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組之間OD值比較有顯著差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,OXA、DDP與5-FU聯(lián)合用藥可有效抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng),呈劑量依賴性。OXA、DDP聯(lián)合5-FU作用胃癌細(xì)胞48h后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率較OXA單藥組及OXA/DDP聯(lián)合用藥組增高(P<0.05),OXA的IC50值顯著下降。
　　4.根據(jù)MTT結(jié)果繪制OXA單藥及聯(lián)合用藥對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823的生長(zhǎng)曲線:不同濃度的O

9、XA單藥及聯(lián)合用藥作用胃癌細(xì)胞48h的體外生長(zhǎng)抑制曲線表明,對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用均呈劑量依賴性,在相同摩爾濃度下,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用由強(qiáng)到弱為OXA/DDP/5-FU>OXA/DDP>OXA。
　　5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)OXA單藥及聯(lián)合用藥對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞周期變化:OXA單藥處理細(xì)胞后,12,24,48h S期細(xì)胞為(21.40±0.46)％,(46.30±1.68)％,(64.93±0.68)％逐漸增加,表現(xiàn)為S期的阻

10、滯。OXA、DDP聯(lián)合處理細(xì)胞后,12,24,48h S期細(xì)胞為(31.67±0.72)％,(49.73±0,76)％,(81.80±0.96)％,G2/M期細(xì)胞逐漸減少,表現(xiàn)為S期的明顯阻滯。OXA、DDP、5-FU聯(lián)合處理細(xì)胞后,12,24小時(shí)S期細(xì)胞為(44.87±1.59)％,(58.60±0.85)％,表現(xiàn)為S期的明顯阻滯,48h出現(xiàn)為S期的明顯減少(37.73±0.71％)。
　　6.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)顯示:OXA單藥

11、及聯(lián)合用藥作用胃癌細(xì)胞48h后,Bcl-2、Bax、Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物定位于胃癌細(xì)胞的胞漿內(nèi),呈棕黃色。
　　6.1.Bcl-2的表達(dá):藥物作用48h后,OXA單藥組Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為(52.46±2.07)％,較對(duì)照組(73.73±2.24)％有所降低(P<0.01);OXA/DDP組Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(37.44±2.42)％較對(duì)照組及OXA單藥組顯著降低(P<0.01);OXA/DDP/5-FU組B

12、cl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(21.91±2.38)％較對(duì)照組及OXA單藥組與OXA/DDP聯(lián)合用藥組顯著降低(P<0.01)。
　　6.2.Bax的表達(dá):藥物作用48h后,OXA單藥組Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為(40.21±0.93)％,與對(duì)照組(19.91±0.70)％比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);OXA/DDP組Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(56.36±0.67)％較對(duì)照組及OXA單藥組顯著升高(P<0.01);OXA/DDP/5-FU

13、組Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(75.88±0.58)％較對(duì)照組、OXA單藥組及OXA/DDP聯(lián)合用藥組顯著升高(P<0.01)。
　　6.3.Caspase-3的蛋白表達(dá):藥物作用48h后,OXA單藥組Caspase-3蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率為(22.20±1.18)％,稍高于對(duì)照組(9.45±1.63)％(P<0.01);OXA/DDP組Caspase-3蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(40.91±1.58)％顯著高于對(duì)照組及OXA單藥組(P<0.01);

14、OXA/DDP/5-FU組Caspase-3蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(65.68±1.57)％顯著高于對(duì)照組、OXA單藥組及OXA/DDP聯(lián)合用藥組(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.OXA、OXA/DDP、OXA/DDP/5-Fu均可抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其抑制作用在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性,聯(lián)合作用時(shí)OXA的IC50值較單藥組明顯下降;
　　2.OXA、OXA/DDP均將細(xì)胞周期阻滯于S期,OXA