急性高氧氧應激過程中大鼠肺泡上皮細胞凋亡的損傷機制探討.pdf

1、目的：建立高濃度氧誘導在體大鼠肺泡細胞凋亡損傷模型，觀察短時間內(4～8小時)吸入高濃度氧肺泡上皮細胞的損傷；觀察一氧化氮及其合酶對急性吸入高濃度氧導致大鼠肺泡上皮細胞凋亡的影響；探討線粒體途徑和細胞酸化在氧化應激早期誘導的肺泡上皮細胞凋亡信號傳導過程中的作用。
　　 方法：WISTAR大鼠放至于氧濃度為80-100％的氧箱中4、8、12、16小時，空氣對照組放置于氧濃度為21％的氧箱中，實驗分三部分，按實驗目的不同制取樣本做如

2、下測試：1．比色法測定血漿、肺組織勻漿中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷光甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)和總抗氧化能力(T-AOC)；胍染色觀察肺組織常規(guī)病理變化，TUNEL染色法檢測肺泡表面凋亡細胞；2．Westernblot檢測肺組織中eNOS和iNOS蛋白表達，RT-PCR檢測eNOSmRNA、iNOSmRNA的表達。3．RT-PCR檢測bcl-2mRNA、baxmRN

3、A、eNOSmRNA、iNOSmRNA的表達，Westernblot檢測bcl-2、bax、Akt1/磷酸化-Akt1、mTOR/磷酸化-mTOR的蛋白表達；BCECF-AM檢測細胞漿pH值，流式細胞儀(Flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測細胞增殖指數(shù)。
　　 結果：1．與對照組相比（凋亡2.17％），吸入高濃度氧4小時即出現(xiàn)典型的肺泡表面凋亡細胞(9.13±3.2％)，8～12小時組凋亡細胞的數(shù)量明顯增加(17.47±3.

4、5％、19.22±4.5％)，16小時組有減少的趨勢(11.03±2.8％)。HE染色切片顯示4小時組肺輕度充血，8小時組肺毛細血管擴張、充血、紅細胞滲出、輕度肺水腫。16小時組開始出現(xiàn)以中性粒細胞為主的炎癥細胞，肺組織水腫明顯、肺大泡和肺不張，甚至可見肺組織增生、結構紊亂。各組血清、肺組織勻漿MDA、NO、NOS顯著升高(P＜0.01)，而SOD、GSH、CAT、T-AOC均顯著降低(P＜0.01)。2．Westenblot檢測發(fā)現(xiàn)，

5、高氧4h組eNOS表達開始升高，8h、12h組后eNOS蛋白質表達升高明顯，16h組高表達但略有下降；高氧各組eNOSmRNA表達顯著增高。對照組iNOS蛋白微量表達，與對照組比較,4h、8h、12h組表達無顯著差異，表達量遠低于eNOS，16h組表達略增強；iNOSmRNA的表達在16h組表達也增強。3．RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)吸氧各組bcl-2mRNA表達明顯降低，baxmRNA表達顯著增高；Westernblot檢測Bax蛋白表達逐漸

6、增強，Bcl-2蛋白、AKT-1/PhosphoAkt-1(Ser473)蛋白、mTOR/Phospho-mTOR蛋白表達逐漸減弱；高氧氧應激后大鼠肺泡上皮細胞Akt/PKB蛋白磷酸化程度都降低，隨吸氧時間延長，Akt/mTOR信號轉導蛋白表達降低更加明顯；BCECF-AM檢測細胞漿pH值顯示隨著吸氧時間的延長，體內ROS水平的不斷升高，F(xiàn)L1/FL2比值不斷降低，凋亡的比例也不斷增加。各時段細胞酸化均較顯著，各組細胞增殖改變和細胞漿酸

7、性變化趨勢相一致。
　　 結論：1．大鼠活體急性高氧氧應激模型實驗發(fā)現(xiàn)，短時間吸入高濃度氧導致急性氧應激時即可導致肺泡上皮細胞凋亡顯著增加，且隨著吸氧時間的延長損傷加重，損傷轉為向炎癥表現(xiàn)發(fā)展。2．氧應激凋亡早期(4-8h)NO大幅升高由eNOS表達增強引起的。16hiNOS和iNOSmRNA表達略增強，但并不高，炎性表現(xiàn)不明顯，說明炎性細胞功能還未被完全激活。3．線粒體膜通透性改變和線粒體通透性轉變孔道的開放，BCL-2/BA

8、X減小，AKT/mTOR及其磷酸化表達均減少，導致PI3/Akt/mTOR信號途徑轉導異常，說明了高氧氧應激早期線粒體途徑應是肺泡上皮細胞凋亡的主要信號傳導路徑。4。高氧氧應激后ROS同時損傷了溶酶體膜的穩(wěn)定性，溶酶體內活性物質的釋放導致線粒體損傷更加嚴重，促使溶酶體參與的線粒體途徑的細胞凋亡機制的發(fā)生。但這種早期損傷還尚未啟動其他如自噬等炎性生理反應，僅凋亡現(xiàn)象表現(xiàn)的非常明顯。5．通過實驗觀察提示氧化應激誘導肺泡上皮細胞凋亡與細胞漿酸

9、化有關，ROS通過直接損傷了細胞質膜抑制Na+/H+交換使細胞內酸化，或者損傷溶酶體膜，釋放大量H+進入細胞漿，導致細胞酸化，這有利于細胞內酸性核酸內切酶等生物活性物質發(fā)揮作用，誘導凋亡。細胞漿酸化程度與細胞凋亡發(fā)生率存在某種量效關系，細胞酸化既可能是細胞凋亡的伴隨現(xiàn)象，同時又可能導致線粒體、溶酶體損傷，加重線粒體始酶體途徑引起的細胞死亡，其機制有待于進一步研究。
　　 本實驗利用大鼠在體活細胞實驗，吸入氧濃度與臨床全麻使用氧濃