慢性酒精中毒腦組織形態(tài)學(xué)變化及Tau蛋白、β-APP表達與TSAH死亡機制關(guān)系的研究.pdf

1、背景與目的：
　　酗酒后輕微外力引起的致死性外傷性蛛網(wǎng)膜下腔出血(traumatic subarachnoid haemorrhage,TSAH)時有發(fā)生,TSAH常與酗酒有關(guān),國內(nèi)外學(xué)者對此已有共識,但其發(fā)生及死亡機制尚未完全清楚。本課題組前期已建立了穩(wěn)定的大鼠灌酒后TSAH模型,結(jié)果顯示,慢性灌酒組大鼠TSAH發(fā)生率及死亡率分別高達81％和76%,遠高于急性灌酒組的27%和4.8%(P<0.01)。綜合相關(guān)文獻及前期實驗結(jié)果,

2、我們提出長期酗酒對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerves systerm,CNS)代謝、功能和形態(tài)各方面的累積性毒理作用,可能構(gòu)成協(xié)同腦震蕩性損傷導(dǎo)致TSAH死亡的神經(jīng)病理學(xué)基礎(chǔ)的假設(shè)。本研究通過觀察慢性灌酒中毒的CNS形態(tài)學(xué)變化,以及與神經(jīng)纖維軸突運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)的Tau蛋白、β-APP表達狀況,探討酗酒與TSAH死亡機制的相關(guān)性。
　　材料與方法：
　　1、動物模型及分組
　　CL級雄性SD大鼠,體重30

3、0±30g,常規(guī)分籠飼養(yǎng),隨機分:灌水組10只、灌水打擊組10只、灌酒組10只、灌酒打擊組29只、灌酒停酒組6只。連續(xù)灌胃食用水或白酒(52%v/v北京紅星二鍋頭)4周,劑量:前2周8ml/kg/次、后2周12ml/kg/次,每天9:00和16:00間隔7小時兩次灌胃。
　　2、方法
　　灌水組和灌酒組最后一次灌胃2h后,戊巴比妥腹腔注射麻醉后股動脈放血處死;灌水打擊和灌酒打擊組用自制單擺式打擊裝置給予腦震蕩性打擊,同時監(jiān)測

4、心電15min,存活大鼠打擊后觀測2h,戊巴比妥腹腔注射麻醉后股動脈放血處死,灌酒打擊組中死亡的大鼠歸為死亡組,各組均立即剖胸主動脈插管,含鈣2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液灌注固定30min,開顱提取全腦,置于4%中性多聚甲醛液固定6h,旁正中矢狀切取腦組織,常規(guī)石蠟連續(xù)切片,分別HE、Bielschowsky’s鍍銀染色及Tau蛋白、β-APP免疫組織化學(xué)染色,光鏡觀察組織病理形態(tài),圖像采集系統(tǒng)觀測、采圖,Image-Pro Pl

5、us 6.0圖像分析軟件累積積分光密度(IODsum)等量化病理學(xué)測量。
　　同時,備制透射電鏡腦組織樣本立即置入2.5%戊二醛中,按常規(guī)方法清洗、固定、包埋、切片、染色,在JEM-1400透射電子顯微鏡下觀察。
　　3、統(tǒng)計分析
　　所有實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示,通過SPSS17.0及Excel 2003分析處理數(shù)據(jù),檢驗方法采用方差分析(ANOVA)、獨立樣本T檢驗、卡方檢驗。統(tǒng)計學(xué)檢驗所得值差異顯著性以P<

6、0.05、P<0.01表示。
　　結(jié)果：
　　1、實驗大鼠一般情況觀察
　　灌水組飲食、活動狀況良好,體重持續(xù)增加,第2w始體重增加明顯(P<0.01)。灌酒組毛發(fā)粗糙、無光澤,精神狀況差,并隨著灌酒時間延長,逐漸出現(xiàn)體形消瘦、營養(yǎng)不良、進食量、活動減少、肢體癱軟等慢性酒精中毒改變。灌酒組大鼠灌酒后體重逐漸下降,第1w、第3w、第4w體重均明顯下降,較灌酒前均差異顯著(P<0.01)。
　　灌水打擊組心電圖呈一過

7、性心率減慢、QRS波群波幅增大,0.3±0.16s后恢復(fù);灌酒打擊組大鼠QRS波群波幅明顯增大,恢復(fù)時間1.7±0.36s,較灌水打擊組明顯延長(P<0.05);打擊死亡組大鼠QRS波幅明顯增大,10s-1min后心率進行性減慢后呈直線。
　　灌酒打擊組TSAH發(fā)生率和死亡率分別為79.3%,51.7%,顯著高于灌水打擊組(P<0.01,P<0.05),根據(jù)Fisher分級法,灌酒打擊組大鼠TSAH級別高于灌水打擊組。
　　

8、2、常規(guī)大體和組織病理學(xué)觀察
　　灌水組神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞形態(tài)和分布正常,神經(jīng)纖維粗細染色均勻、排列平直緊密。灌水打擊組全腦輕度淤血,散在局限性小灶性出血,神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞輕度水變性,尼氏體淺淡、數(shù)目減少,神經(jīng)纖維不規(guī)則扭曲增粗、斷裂、周隙擴大,排列疏松。
　　灌酒組全腦表面輕度淤血,神經(jīng)元排列紊亂,形態(tài)不一,散在固縮深染1型變和腫脹淡染2型變神經(jīng)元,胞體腫大變圓,核增大、偏位,中央性尼氏體溶解、消失;膠質(zhì)細胞增生;小腦蒲肯野

9、細胞固縮、數(shù)目減少、疏密不均;神經(jīng)纖維排列稍疏松、間隙增大,輕度不規(guī)則增粗、變形。
　　灌酒打擊組全腦表面彌漫淤血,腦干周圍多見厚層TSAH,未見明顯腦挫裂傷,神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞高度水變性、周隙擴大,多見核固縮、溶解、消失,中央尼氏體不同程度邊集、溶解、消失,多見噬神經(jīng)及衛(wèi)星現(xiàn)象;散在神經(jīng)元脫失,膠質(zhì)細胞增生;小腦蒲肯野細胞不規(guī)則減少,染色、疏密不均、核固縮;延腦多見紅色神經(jīng)元及暗神經(jīng)元;神經(jīng)纖維疏松水腫、周隙增寬,可見明顯增粗

10、、扭曲、斷裂,局部腫脹明顯。灌酒停酒組大鼠較灌酒組神經(jīng)元及神經(jīng)纖維病變有所緩解。
　　3、透射電鏡觀察
　　灌水組腦干組織致密,神經(jīng)纖維軸索粗細均勻、形態(tài)規(guī)整,電子密度較高,髓鞘深色、厚薄均勻,軸膜和髓鞘結(jié)合緊密,神經(jīng)骨架纖維粗細均勻;神經(jīng)元核、線粒體、高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富,大小形態(tài)、排列規(guī)整,多見核糖體。灌水打擊組組織較疏松水腫,電子密度較低,神經(jīng)纖軸索粗細、深淺不均,髓鞘厚薄不一、散在裂隙分層;神經(jīng)骨架纖維水腫、排列

11、松散;神經(jīng)元線粒體疏松腫脹、嵴擴張,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴大,突觸間隙增寬、致密斑密度降低。
　　灌酒組腦干組織疏松水腫,神經(jīng)軸索彌漫粗細、形態(tài)不均、排列紊亂,髓鞘不規(guī)則分層、厚薄不均,神經(jīng)纖維軸漿疏密不均,神經(jīng)骨架纖維粗細不一、部分溶解,髓鞘脂質(zhì)散在裂隙分層,神經(jīng)元線粒體明顯疏松腫脹、嵴長短粗細不一、外膜不完整,可見胞體、核固縮神經(jīng)元,核膜皺折、異染色質(zhì)增多、聚集,核仁固縮;膠質(zhì)細胞增多,間質(zhì)疏松水腫。灌酒打擊組腦干神經(jīng)纖維髓鞘高度疏松水

12、腫,可見板層分離、褶疊和內(nèi)陷,絮狀物附著,部分區(qū)域形成囊泡樣突起突入周圍間隙中;神經(jīng)骨架纖維崩解,局部被絮狀沉淀物和膜性結(jié)構(gòu)所代替,周邊可見膜性細胞器的積聚,可見空化的線粒體;突觸數(shù)量減少,突觸小泡堆積;膠質(zhì)細胞增多,間質(zhì)水腫;在軸膜和髓鞘改變區(qū),軸漿和細胞器逐漸積聚,呈反應(yīng)性軸突腫脹;神經(jīng)元體積明顯縮小,胞漿及核電子密度增高、核膜皺折,異染色質(zhì)團塊狀聚集,核仁消失或變小,核漿比例增大,胞周縫隙增寬,胞膜不完整,線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯疏松腫

13、脹。灌酒停酒組大鼠較灌酒組神經(jīng)元及神經(jīng)纖維病變有所緩解,水腫減輕。
　　4、免疫組化觀察
　　4.1、Tau蛋白IOD sum值
　　正常組腦組織Tau蛋白主要在神經(jīng)元的軸突和胞漿陽性表達。灌酒組腦干、小腦、海馬、額葉等腦區(qū)Tau IOD sum值顯著減小(P<0.05)。灌水打擊組額葉腦區(qū)Tau IOD sum值顯著增高(P<0.05),腦干、小腦、海馬等部位Tau IOD sum值變化差異不顯著(P>0.05)。慢

14、性灌酒打擊組腦干、小腦、海馬、額葉等部位Tau IOD sum值顯著增高(P<0.05)。慢性灌酒打擊死亡組腦干、海馬、額葉等部位Tau IOD sum值均高于慢性灌酒打擊存活組(P<0.05)。
　　4.2、β-APP IOD sum值
　　正常組β-APP主要在神經(jīng)元胞漿陽性表達。灌酒組腦干、小腦、海馬等腦區(qū)IOD sum值顯著增高(P<0.05),額葉變化不顯著(P>0.05)。灌水打擊組腦干、海馬等腦區(qū)β-APP I

15、OD sum值顯著增高(P<0.05),小腦、額葉等部位差異不顯著(P>0.05)。慢性灌酒打擊組腦干、小腦、海馬、額葉等部位β-APP IOD sum值顯著減小(P<0.05)。慢性灌酒打擊死亡組小腦、海馬等部位β-APP IOD sum值均顯著高于慢性灌酒打擊存活組(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、慢性酒精中毒可引起CNS神經(jīng)纖維細胞骨架的形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞,降低傳導(dǎo)功能的代償性,導(dǎo)致易損性增加,提示其可能為慢性酗酒后,

16、在腦震蕩性打擊下高死亡率發(fā)生的病理形態(tài)基礎(chǔ)。
　　2、大鼠腦干、小腦、海馬、額葉等腦區(qū)Tau蛋白、β-APP的表達和分布顯示,慢性酒精中毒顯著降低CNS骨架蛋白Tau表達、上調(diào)CNSβ-APP的表達,分析認為上述變化可能是長期慢性酗酒腦白質(zhì)萎縮、神經(jīng)突起數(shù)量減少的機制之一,參與了慢性酒精中毒TSAH死亡的病理代謝基礎(chǔ)。
　　3、結(jié)合本課題組前期工作結(jié)果,認為酗酒相關(guān)的TSAH中,慢性酒精累積性CNS毒理學(xué)效應(yīng)構(gòu)成了神經(jīng)損傷的