紅景天對(duì)AOPPs誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響.pdf

1、研究背景：
　　 慢性腎臟?。╟hronic kidney diseases，CKD）是絕大多數(shù)腎臟疾病的臨床統(tǒng)稱(chēng);除了急性腎炎和急性尿路感染（腎臟急性炎癥性疾?。┩猓伎梢詺w屬慢性腎臟病的范圍;本病是一個(gè)緩慢發(fā)展相對(duì)良性的疾?。ɑ蚬餐呐R床病理過(guò)程）;各種泌尿系統(tǒng)疾病包括糖尿病腎病、原發(fā)性腎小球疾病、中毒性腎病、良性小動(dòng)脈性腎硬化癥、缺血性腎病、梗阻性腎病等若未能有效及時(shí)診治，均可導(dǎo)致病情進(jìn)展、惡化或隨病程遷延，發(fā)展成為慢性腎

2、功能不全或腎衰竭，最終形成尿毒癥。
　　 腎臟纖維化是各種慢性腎臟病的最終結(jié)果和必然結(jié)局。從病理上來(lái)說(shuō)，腎臟纖維化是多種慢性腎臟病的共同病理基礎(chǔ)，同時(shí)也是各種慢性腎臟病發(fā)展為終末期腎衰竭的重要途徑。腎臟纖維化包括腎小球纖維化、腎小管纖維化和腎間質(zhì)纖維化，三者密切相連，都與腎功能下降程度直接相關(guān)。無(wú)論腎小球、腎小管、還是腎間質(zhì)，巨噬細(xì)胞的活化、組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生及ECM轉(zhuǎn)換失去平衡等是它們纖維化的過(guò)程和機(jī)制中恒定的細(xì)胞

3、分子事件。細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生細(xì)胞主要包括有:成纖維細(xì)胞、小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞及局部浸潤(rùn)的單核細(xì)胞，這些細(xì)胞可轉(zhuǎn)分化成為表達(dá)α-SMA的MFB，肌成纖維細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物主要是α-SMA，現(xiàn)已認(rèn)為α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物且具有特異性，另它是腎小球疾病系膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和受損激活的標(biāo)志。足細(xì)胞是高度分化的細(xì)胞，不可再生，它形成多重指突狀足突。相鄰的足突之間相互連接形成裂孔，形成一層裂孔隔膜，附著在腎小球毛細(xì)血管基底膜的外層。足細(xì)胞通過(guò)

4、減弱腎小球基底膜的向外膨脹作用起到穩(wěn)定腎小球結(jié)構(gòu)的作用，足細(xì)胞功能的缺失在蛋白尿形成過(guò)程以及腎小球纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，最終可引起腎臟纖維化。腎臟纖維化的本質(zhì)是過(guò)度產(chǎn)生的胞外成分代替了腎臟固有結(jié)構(gòu)。近年來(lái)的研究顯示，合成細(xì)胞外基質(zhì)的成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞來(lái)源的重要途徑是已分化上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)。EMT是腎臟纖維化的過(guò)程中早期和可逆的變化。假如能

5、夠逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞EMT，將會(huì)有力阻斷CKD的發(fā)展。研究足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的機(jī)制，成為進(jìn)一步探明腎臟纖維化發(fā)生機(jī)制的重要的切入點(diǎn)和突破口。
　　 晚期氧化蛋白產(chǎn)物（Advanced oxidation protein products，AOPPs）最早是在血液透析的患者循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的氧化修飾蛋白，體外試驗(yàn)提示，AOPP不僅成為氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，還能夠激發(fā)單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)，也可能是炎癥的中介因子。血漿晚期氧化蛋白產(chǎn)物的蓄積在糖尿病

6、、代謝綜合征、慢性腎臟病等疾病中非常常見(jiàn)。近年的研究顯示，在殘余腎模型中血漿AOPPs的慢性蓄積顯著增加了尿蛋白的排泄并加速了腎小球硬化。慢性腎臟病患者（如IgA腎?。┭h(huán)中AOPP水平與腎臟病進(jìn)展速度相關(guān)，蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物潴留水平與慢性腎臟病的微炎癥反應(yīng)相關(guān)。近來(lái)，AOPPs在CKD的致病作用逐漸引起廣泛關(guān)注，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)AOPPs可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞及足細(xì)胞發(fā)生EMT，這提示CKD發(fā)病機(jī)制的早期關(guān)鍵環(huán)節(jié)可能是AOPPs導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生

7、了EMT。
　　 紅景天是薔薇目景天科(Crassulaceae)紅景天屬(Rhodiola L.)多年生草本或亞灌木野生植物，因花、根、莖之浸液均為紅色而得名。紅景天苷是其主要的活性成分。有研究觀察紅景天苷對(duì)過(guò)氧化脂質(zhì)(LPO)、大鼠肝臟勻獎(jiǎng)超氧化物歧化酶(SOD)酶活性、血清中LPO以及還原型谷胱甘肽-Px(GSH-Px)的影響，結(jié)果顯示紅景天苷可以顯著提高大鼠肝臟GSH-Px活性和SOD活性，抑制大鼠血清和肝臟LPO的生成

8、，說(shuō)明紅景天苷具有較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用。還有證據(jù)表明紅景天可改善低氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、減少α-SMA的表達(dá)、減少細(xì)胞外基質(zhì)的增加，起到抑制腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用，從而能夠緩解腎間質(zhì)的損害，防治腎間質(zhì)纖維化。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western蛋白印跡分析技術(shù)，探討紅景天對(duì)AOPPs誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。
　　 一、研究目的
　　 觀察AOPPs培養(yǎng)對(duì)小鼠足細(xì)胞G

9、rp78、CHOP以及α-SMA、nephrin、podocin蛋白表達(dá)的影響及紅景天干預(yù)后Grp78、CHOP、α-SMA、nephrin、podocin蛋白表達(dá)的變化。探討紅景天是否可以通過(guò)ERS途徑從而逆轉(zhuǎn)小鼠足細(xì)胞EMT。
　　 二、研究方法
　　 1.制備AOPP:采用Witko-Sarsat等介紹的方法，將人血清白蛋白(HSA)與次氯酸溶液以1/140的摩爾比例混合，室溫下反應(yīng)30min(25～30℃)，在無(wú)

10、菌PBS中透析24小時(shí)以去除殘留次氯酸，制備的AOPP-HSA加入β-巰基乙醇終止反應(yīng)，離心超濾30min，加入適量PBS沖洗，再次離心超濾。AOPP含量通過(guò)測(cè)定酸性條件下340nm處吸光度值，以氯氨T為標(biāo)準(zhǔn)取得。
　　 2.小鼠永生性足細(xì)胞培養(yǎng)傳代轉(zhuǎn)入37℃不含γ-干擾素的RPMI1640培養(yǎng)液中，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱繼續(xù)分化后使用。
　　 3.觀察AOPP刺激后的足細(xì)胞形態(tài)并檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)α-SMA蛋白最大效應(yīng)劑量點(diǎn)

11、及最佳效應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，得到最大效應(yīng)劑量點(diǎn)AOPP濃度為200μg/ml，最佳效應(yīng)時(shí)間點(diǎn)為24小時(shí)。
　　 4.根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⑷考?xì)胞分成10組培養(yǎng):MPC5空白對(duì)照組、MPC5+BSA組、MPC5+AOPP組、MPC5+AOPP+salidroside(0.1μmol/L)組、MPC5+AOPP+salidroside(1μmol/L)組、MPC5+AOPP+salidroside(10μmol/L)組、MPC5+AOPP+sali

12、droside(100μmol/L)組、MPC5+AOPP+salidroside(200μmol/L)組、MPC5+thapsigargin(0.25μmol/L)組、MPC5+thapsigargin(0.25μmol/L)+salidroside(200μmol/L)組。
　　 5.將各組細(xì)胞分別培養(yǎng)，于24h時(shí)收集細(xì)胞以Western blot方法檢測(cè)Grp78、CHOP、α-SMA、nephrin、podocin的蛋白

13、表達(dá)水平。
　　 三、結(jié)果
　　 1.Western blot測(cè)定各組Grp78及CHOP的蛋白表達(dá)水平
　　 觀察1-3組，空白組及白蛋白組基本不表達(dá)Grp78及CHOP蛋白;在AOPPs(200μg/ml)作用后，足細(xì)胞Grp78、CHOP蛋白表達(dá)增高(P＜0.01);不同濃度紅景天（0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）干預(yù)后，Grp78、CHOP蛋白

14、表達(dá)降低(P＜0.05)且呈劑量依賴(lài)性下降(P＜0.05)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道Thapsigargin作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑可特異性的作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而對(duì)其他細(xì)胞器無(wú)干擾，本實(shí)驗(yàn)觀察到毒胡蘿卜素同樣可引起Grp78、CHOP蛋白表達(dá)增高(P＜0.01)，紅景天干預(yù)后毒胡蘿卜素組的Grp78、CHOP蛋白表達(dá)降低(P＜0.01)。
　　 2.Western blot測(cè)定各組α-SMA、nephrin、podocin的蛋白表達(dá)水平

15、　　 觀察1-3組，與空白組及白蛋白組對(duì)比，AOPPs(200μg/ml)作用后，足細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)水平增高而nephrin及podocin蛋白表達(dá)水平降低(P＜0.01);不同濃度紅景天(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)干預(yù)后，α-SMA蛋白表達(dá)水平降低及nephrin、podocin蛋白表達(dá)增高(P＜0.05)。毒胡蘿卜素作用于足細(xì)胞可引起α-SMA蛋白表達(dá)增高及

16、nephrin、podocin蛋白表達(dá)降低(P＜0.01);紅景天干預(yù)后毒胡蘿卜素組足細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)水平降低及nephrin、podocin蛋白表達(dá)水平增高(P＜0.01)
　　 四、結(jié)論
　　 本研究成功觀察到AOPPs刺激下培養(yǎng)的足細(xì)胞Grp78、CHOP、α-SMA的蛋白水平升高，同時(shí)有nephrin及podocin蛋白表達(dá)水平的下調(diào)。紅景天作為干預(yù)條件，作用后Grp78、CHOP、α-SMA蛋白表達(dá)水平下