OXPAT對(duì)原代培養(yǎng)肝細(xì)胞脂滴形態(tài)的影響.pdf

1、脂肪代謝異常，如肥胖癥（Obesity）和高脂血癥（Hyperlipidemia）等疾病已成為嚴(yán)重危害人民健康的常見疾病之一。脂肪（Fat）是機(jī)體能量?jī)?chǔ)存的一種重要方式，細(xì)胞內(nèi)中性脂肪，如甘油三酯（Triglyceride，TG）和膽固醇酯（CholesterolEster，CE），主要以脂滴（LipidDroplet,LD）的形式存在，脂滴廣泛地存在于多種組織細(xì)胞中，如脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)和肌肉細(xì)胞等。脂滴的表面是為單層磷脂結(jié)

2、構(gòu)，并鑲嵌著多種脂滴相關(guān)蛋白（LipidDropletAssociatedProteins）。脂滴相關(guān)蛋白在脂滴的分解、合成和融合過程中具有重要的作用。PAT家族蛋白在脂滴代謝過程中具有重要作用。1990年人們發(fā)現(xiàn)了脂滴表面的第一個(gè)蛋白Perilipin，此后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)ADRP、TIP47、S3-12、Vimentin、Caveolin-1、CGI-58等許多蛋白也位于脂滴的表面，這些蛋白統(tǒng)稱為脂滴相關(guān)蛋白。近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法應(yīng)用

3、于脂滴表面蛋白的分析，大大提高了脂滴相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)的速度。通過蛋白質(zhì)組學(xué)的分析，目前將脂滴相關(guān)蛋白主要分成三類：一類是與脂滴特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)蛋白，一類是與脂質(zhì)代謝有關(guān)的酶類或轉(zhuǎn)運(yùn)體，還有一類是相關(guān)資料過少而尚未分類的蛋白。一些研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)狀態(tài)和激活狀態(tài)時(shí)，都位于脂滴表面的結(jié)構(gòu)蛋白有Perilipin、S3-12、Vimentin和ADRP；而TIP47、Caveolin-1和Tubulin只在刺激狀態(tài)下出現(xiàn)在脂滴表面。不同條件下脂滴表面

4、的蛋白種類和數(shù)量發(fā)生變化，提示這些蛋白可能是以脂滴表面為平臺(tái)來(lái)發(fā)揮對(duì)脂滴代謝的調(diào)節(jié)作用。OXPAT是Perilipin的同源蛋白，但其主要分布于脂肪分解代謝速度較快的組織細(xì)胞中，如肝細(xì)胞和肌肉細(xì)胞。目前的研究發(fā)現(xiàn)，OXPAT能夠激活PPAR途徑，而促進(jìn)細(xì)胞中脂肪酸的分解代謝。
　　1．在本研究中，我們利用OXPAT特異性引物從小鼠肝臟的cDNA文庫(kù)中克隆了OXPAT基因，經(jīng)測(cè)序，與Genebank公布的一致。同時(shí)，我們構(gòu)建了OXP

5、AT與凝血素（Hemagglutinin，HA）基因融合表達(dá)質(zhì)粒pCMV5-HA-OXPAT。通過轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，利用Bodipy493/503進(jìn)行脂滴染色，經(jīng)熒光顯微檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)OXPAT定位于脂滴表面，該結(jié)果與公布的研究結(jié)果一致。
　　2．我們利用AdEasy-1腺病毒系統(tǒng)，構(gòu)建了攜帶OXPAT的腺病毒。首先，通過分子生物學(xué)手段構(gòu)建pShuttle-HA-OXPAT質(zhì)粒。pShuttle-HA-OXPAT質(zhì)粒經(jīng)PmeI線性

6、化后，與pAdEasy-1質(zhì)粒在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行重組，獲得pAd-HA-OXPAT質(zhì)粒。利用PacI線性化pAd-HA-OXPAT，采用Lipofectacmine2000轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在培養(yǎng)的第9天出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的腺病毒。采用293T細(xì)胞測(cè)定病毒滴度，結(jié)果表明病毒的滴度大于2×109/ml，并能夠有效在293T細(xì)胞中表達(dá)。
　　3．我們研究發(fā)現(xiàn)

7、OXPAT能夠降低肝細(xì)胞中脂肪的含量和減小脂滴的體積。我們采用肝臟灌注和膠原酶消化的方法，分離小鼠的肝臟細(xì)胞，并在體外進(jìn)行培養(yǎng)，分離的肝細(xì)胞的存活率大于95％。我們利用攜帶OXPAT的腺病毒感染體外培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞，采用WesternBlot檢測(cè)OXPAT的表達(dá)，通過對(duì)肝細(xì)胞脂形態(tài)的觀察，我們發(fā)現(xiàn)，OXPAT能夠減小脂滴的體積，同時(shí)肝細(xì)胞中脂肪含量減少。
　　綜上所述，本研究從小鼠肝臟cDNA文庫(kù)中克隆了OXPAT基因，并在COS