Lef1和Msx2基因在阿爾巴斯絨山羊毛乳頭細胞增殖中的調(diào)控作用.pdf

1、羊絨在絨山羊毛囊中發(fā)育形成，由毛乳頭細胞通過多種信號通路來調(diào)控其生長和發(fā)育，因此毛乳頭細胞也被稱為是調(diào)控毛囊發(fā)育和周期的控制中心。內(nèi)蒙古絨山羊毛囊具有兩種類型，包括初級毛囊和次級毛囊。這兩種毛囊分別會產(chǎn)生羊毛和羊絨兩種不同類型的毛纖維。調(diào)控這兩種毛囊的生長和發(fā)育是多種信號因子相互作用的結(jié)果。本實驗以阿爾巴斯絨山羊兩種毛乳頭細胞為模型，研究與絨毛生長相關(guān)的Lef1和Msx2基因?qū)γ轭^細胞的增殖作用。
　　1、過表達和干擾載體的構(gòu)建

2、
　　通過基因片段克隆、酶切和連接等方法，成功構(gòu)建了4種載體，分別是Lef1基因過表達載體、Lef1干擾載體、Msx2基因過表達載體和Msx2基因干擾載體。
　　2、阿爾巴斯絨山羊初級和次級毛乳頭細胞的培養(yǎng)及鑒定通過常規(guī)細胞培養(yǎng)法，本實驗成功培養(yǎng)了阿爾巴斯絨山羊的初級和次級毛乳頭細胞，并利用熒光免疫法檢測毛乳頭細胞的特異性標記因子α-SMA和CD133，鑒定本實驗所培養(yǎng)的細胞確實為毛乳頭細胞。
　　3、Lef1基因的過

3、表達和干擾細胞株的轉(zhuǎn)染及檢測
　　通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將Lef1基因的過表達載體和干擾載體成功轉(zhuǎn)入阿爾巴斯絨山羊的初級和次級毛乳頭細胞中，大量培養(yǎng)后，得到Lef1基因的4種細胞株，分別為Lef1基因過表達的初級和次級毛乳頭細胞株，以及Lef1基因干擾的初級次級毛乳頭細胞株。Real-time PCR和Western Blot檢測Lef1基因及相關(guān)基因β-catenin、C-myc和cyclin D1的表達量發(fā)現(xiàn):以未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的細

4、胞作為實驗對照組，在初級毛乳頭細胞中Lef1過表達和干擾組的表達量分別是對照的9.25和0.2倍。而在次級毛乳頭細胞中，Lef1過表達和干擾組的表達量分別是對照的10.53和0.21倍。實驗結(jié)果表明本實驗成功建立了Lef1基因的四種細胞株。在實驗中檢測各個樣本中Lef1、β-catenin、C-myc和cyclin D1基因的表達情況發(fā)現(xiàn):兩種毛乳頭細胞中Lef1基因的表達變化與β-catenin、C-myc和cyclin D1基因的表

5、達變化趨勢一致。實驗結(jié)果表明:在兩種毛乳頭細胞中Lef1基因與β-catenin、C-myc和cyclin D1基因的表達呈正相關(guān)性。
　　同時也比較了Lef1基因的四種細胞株中相關(guān)基因的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn):Lef1、β-catenin、cyclin D1在次級毛乳頭細胞中的表達量分別是初級毛乳頭細胞的1.28、2.19、1.16倍。而C-myc在次級毛乳頭細胞中表達量是初級毛乳頭細胞的0.37倍。實驗結(jié)果表明:與絨毛生長的相關(guān)的

6、Lef1、β-catenin、cyclin D1和C-myc基因在兩種毛乳頭細胞中的表達量是不同的。
　　4.Msx2基因的過表達和干擾細胞株的轉(zhuǎn)染及檢測
　　通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將Msx2基因的過表達載體和干擾載體成功轉(zhuǎn)入阿爾巴斯絨山羊的初級和次級毛乳頭細胞中，大量培養(yǎng)后，得到Msx2基因的4種細胞株，分別為Msx2基因過表達的初級和次級毛乳頭細胞株，以及Msx2基因干擾的初級和次級毛乳頭細胞株。Real-time PCR和

7、Western Blot檢測Msx2基因及相關(guān)基因Lef1、BMP-2的表達量發(fā)現(xiàn):以未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的細胞作為實驗對照組，在初級毛乳頭細胞中Msx2過表達和干擾組的表達量分別是對照的11.85和0.31倍。在次級毛乳頭細胞中，Msx2過表達和干擾組的表達量分別是對照的10.59和0.45倍。實驗結(jié)果表明本實驗成功建立了Msx2基因的四種細胞株。在實驗中檢測各個樣本中Msx2、Lef1和BMP-2基因的表達情況發(fā)現(xiàn):在兩種毛乳頭細胞中Ms

8、x2基因的表達與Lef1和BMP-2基因的表達變化趨勢一致。實驗結(jié)果表明:在毛乳頭細胞中Msx2基因的表達與Lef1和BMP-2基因的表達呈正相關(guān)性。
　　通過對各細胞株生長情況的觀察，發(fā)現(xiàn)Lef1和Msx2基因?qū)γ轭^細胞的增殖能力起到正調(diào)控作用，Lef1和Msx2基因的干擾使得毛乳頭細胞的增殖能力下降。
　　上述實驗研究表明:在毛乳頭細胞中Lef1基因與β-catenin、C-myc和cyclinD1基因呈正相關(guān)性的調(diào)控