HaSNPV幾丁質(zhì)酶基因原核與真核的構(gòu)建及表達研究.pdf

1、棉鈴蟲是我國重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一，常常造成巨大的經(jīng)濟損失。而化學(xué)農(nóng)藥長期大量的使用，不僅使得棉鈴蟲的抗藥性劇增，且污染環(huán)境。棉鈴蟲單核衣殼核多角體病毒(HaSNPV)是棉鈴蟲專一性病原微生物，具有寄主范圍特異、對靶標(biāo)高毒力、無藥害、使用安全、害蟲不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，是理想的害蟲控制因子。但傳統(tǒng)病毒殺蟲劑殺蟲作用緩慢、范圍窄等限制了它的使用。在HaSNPV基因組中發(fā)現(xiàn)的18家族幾丁質(zhì)酶基因是一個晚期非必需基因，與受染蟲體液化和病毒侵染機制密

2、切相關(guān)，因而對該基因進行深入研究，將對病毒殺蟲劑的遺傳改良和新的表達系統(tǒng)的建立有著重要的意義。 在研究中，將HaSNPV幾丁質(zhì)酶基因構(gòu)建到具有高效分泌，且易于外源蛋白正確折疊的原核表達載體pMAL-p2X中，以期得到可溶性目的蛋白。本實驗采用常規(guī)的分子生物學(xué)方法構(gòu)建重組體，DNA測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化表達宿主菌TB1，以IPTG為誘導(dǎo)劑，采用26℃低溫下，誘導(dǎo)表達4小時，得到了融合蛋白，其量約占總蛋白的14.7％，上清中分泌的可溶

3、目的蛋白含量約占總目的蛋白的20％以上。此研究為下一步的純化、制備特異性抗體、蛋白的復(fù)性和生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。 為了克服HaSNPV幾丁質(zhì)酶基因在原核表達系統(tǒng)中存在的不易分離純化、蛋白無活性等問題，本研究改用真核表達系統(tǒng)。實驗中，首先將目的基因克隆構(gòu)建到過渡載體pMD18-T-Vecter中，經(jīng)轉(zhuǎn)化、酶切和鑒定，再將目的基因克隆到真核表達質(zhì)粒pPIC9K中，測序鑒定重組子正確后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，以甲醇為