CD151對大鼠心肌梗死后血運重建及心功能的影響.pdf

1、研究背景和目的 冠心病是臨床常見的心血管疾病，其發(fā)病在我國呈明顯上升趨勢。心肌缺血后的血運重建對保護心臟功能、改善遠期預(yù)后起著關(guān)鍵作用。盡管PTCA及CABG在臨床被廣泛應(yīng)用，但大部分患者不能實施或無法恢復(fù)有效血運，血管生成的基因治療則為缺血性心血管病的治療開辟了新的途徑。血管內(nèi)皮細胞的粘附和遷移是血管形成的重要生理步驟之一，在心肌缺血后的血運重建中起著舉足輕重的作用。以往的研究大都集中在血管內(nèi)皮細胞生長因子(vasculare

2、ndothelialgrowthfactor,VEGF)在血管形成中的作用，但二期臨床試驗證明VEGF及FGF的效果不理想，他們并不能促進功能血管的形成。因此，必須尋找新的靶點能夠促進有功能血管的形成，才能達到真正意義上的血管重建。我們將著眼于血管內(nèi)皮細胞粘附和遷移在體內(nèi)血管形成中的作用，這一研究對缺血性心臟病的治療具有重要的理論及實踐意義。 整合素家族在細胞的分化、增殖及移行等一系列生物活動中起著重要作用，主要通過與眾多跨膜蛋

3、白相互作用從而激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)得以完成。與其作用密切的主要是四跨膜超家族蛋白(transmembrane-4superfamily,TM4SFproteins，alsocalledtetraspanins)，它在細胞增殖、融合、遷移及體外血管生成中的作用已被認識。Tetraspanins在哺乳動物的細胞或組織中廣泛表達，有27個家族成員，這些蛋白彼此相連也可與其他蛋白相連，組成一個“Tetraspanin網(wǎng)絡(luò)”。對細胞粘附和遷移的調(diào)節(jié)

4、是這一家族最重要的特性，其中與整合素作用最為密切的Tetraspanins成員為CD151，其高表達于上皮細胞、內(nèi)皮細胞、血小板、巨核細胞及一些未成熟造血細胞。CD151在血管內(nèi)皮細胞形成及體內(nèi)外血管生成中起重要作用，目前大多數(shù)研究均表明啟動內(nèi)皮細胞粘附、遷移和血管形成的信號從細胞外向細胞內(nèi)傳遞是通過integrin-Tetraspanin-PKC復(fù)合體這一模式來完成的。 大量體外研究利用Matrigel模型觀察CD151在維持

5、細胞形態(tài)及體外血管生成中的作用，發(fā)現(xiàn)在抗CD151及抗a6β1抗體分別干預(yù)下，血管內(nèi)皮細胞在Matrigel上的網(wǎng)格狀形成能力明顯受抑。CD151通過與整合素的特異性結(jié)合介導(dǎo)著內(nèi)皮細胞的粘附和遷移，在血管形成(angiogenesis)與重塑中起著關(guān)鍵作用。上述研究證實CD151在內(nèi)皮細胞間及與基質(zhì)間的粘附及遷移、血管生成中起重要作用。但這些研究多集中在CD151與整合素結(jié)合的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式，且促血管形成研究均以細胞系為材料，CD151在

6、整體水平促血管形成的效應(yīng)又是怎樣的呢? 前期研究中，我們證實了CD151在原代血管內(nèi)皮細胞中也具有明顯的促毛細管狀形成作用，并建立了高表達CD151的血管內(nèi)皮細胞系，觀察到它與普通內(nèi)皮細胞在粘附遷移、血管形成中存在顯著差異。我們將攜帶CD151基因的重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染大鼠后肢缺血模型，發(fā)現(xiàn)后肢微血管密度及運動耐力明顯高于未轉(zhuǎn)染CD151組，初步確定了CD151在體內(nèi)促血管生成的作用。在此，我們構(gòu)建CD151重組質(zhì)粒，用于心肌缺血

7、(或心肌梗死)大鼠模型，使CD151在缺血大鼠心肌中表達上調(diào)，觀察CD151的表達對心肌缺血(或心肌梗死)后心肌梗死面積、心肌血管再生及心功能的影響，以證實CD151在心肌缺血后血運重建中的作用，且對CD151在血管形成的機制方面進行探討，為冠心病及其他缺血性疾病的治療探索出一新的途徑。 研究方法 首先通過PCR方法將CD151基因末端連接HA尾(HA-tag)克隆到雙鏈腺相關(guān)病毒表達載體pAAV上，構(gòu)建pAAV-CD1

8、51重組質(zhì)粒，按同法構(gòu)建對照質(zhì)粒pAAV-GFP。質(zhì)粒擴增、提取，氯化銫梯度離心法純化質(zhì)粒。 心肌梗死模型制備、實驗分組及CD151基因的心肌轉(zhuǎn)染雄性Sprague-Dawley成年大鼠48只，隨機分為4組：①假手術(shù)組：開胸后不結(jié)扎左前降支，;②心肌梗死組：結(jié)扎左前降支，在結(jié)扎點以下左室前壁分點注射生理鹽水為對照；③心肌梗死+心肌轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pAAV-GFP組：結(jié)扎左前降支，左室前壁分點注射質(zhì)粒pAAV-GFP；④心肌梗死+心肌

9、轉(zhuǎn)染pAAV-CD151組：結(jié)扎左前降支，分5點注射質(zhì)粒pAAV-CD151。轉(zhuǎn)染四周后進行如下幾個方面的研究：(1)二維超聲心動圖進行大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)及室壁厚度的測定，評價心功能的變化；(2)左心室血流動力學(xué)監(jiān)測左室舒張末壓(LVEDP)、左室收縮壓峰值(LVPSP)及左室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)；(3)Westernblot免疫印跡檢測心肌中CD151的表達水平，評價pAAV-CD15

10、1在大鼠心肌中的轉(zhuǎn)染效果；(4)血管內(nèi)皮細胞特異性抗原FactorⅧ相關(guān)抗原抗體SP免疫組化方法標(biāo)記血管內(nèi)皮細胞進行心肌微血管密度(microvesseldensity,MVD)的測定，評價CD151對心肌梗死后血運重建的影響。 實驗結(jié)果 成功建立了大鼠心肌梗死模型，術(shù)后四周病理切片可見正常心肌細胞排列有序，梗死心肌為大量結(jié)構(gòu)紊亂纖維組織取代。(1)pAAV-CD151在大鼠心肌中的轉(zhuǎn)染效果：Westernblot免疫E

11、跡檢測四組大鼠心肌中CD151蛋白表達相對吸光度值依次為0.98±0.14、0.910.09、1.07±0.13和1.980.23，可見轉(zhuǎn)染CD151基因后大鼠心肌中CD151的表達水平明顯提高(P＜0.01)。(2)CD151表達上調(diào)對大鼠心肌梗死后心功能的影響：二維超聲及左室心導(dǎo)管測定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CD151基因組EF、FS及LVPSP及±dp/dtmax等反映左室收縮功能指標(biāo)分別為(64.0±8.7)％、(32.5±5.2)％、66

12、20.2±884.6(mmHg/s)和5311.6±584.0(mmHg/s)，明顯高于未轉(zhuǎn)染CD151的GFP對照心肌梗死組(41.8±6.5)％、(18.8±2.6)％、5102.1±715(mmHg/s.)4418.8±542.9(mmHg/s)，各指標(biāo)均P＜0.01。(3)CD151對梗死后心肌微血管密度的影響：免疫組化染色分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CD151組心肌微血管密度385.4±79.9(n/mm2)明顯高于轉(zhuǎn)染GFP心梗對照組2

13、40.8±40.3(n/mm2)(P＜0.01)，可見CD151可明顯促進梗死后心肌中微血管的生成，有利于心肌缺血后的血運重建。 結(jié)論 上述實驗結(jié)果證實： 1.pAAV-CD151直接大鼠心肌內(nèi)注射進行CD151基因的轉(zhuǎn)染可明顯上調(diào)心肌中CD151的表達。 2.CD151表達的增強可明顯促進梗死后大鼠心肌微血管的生成，有利于缺血后的血運重建。 3.上調(diào)大鼠心肌中CD151的表達，可明顯改善大鼠梗死