應(yīng)用脂肪干細(xì)胞與脫細(xì)胞真皮構(gòu)建組織工程皮膚.pdf

1、研究目的： 探索脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)向表皮細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，分析ADSCs誘導(dǎo)分化的表皮細(xì)胞是否具有干細(xì)胞的特性。 觀察人脫細(xì)胞真皮的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分析其做為組織工程皮膚支架材料的合理性。探索應(yīng)用ADSCs源類表皮干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞真皮體外構(gòu)建組織工程皮膚的方法，觀察該組織工程皮膚的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 應(yīng)用構(gòu)建的組織工程皮膚修復(fù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮

2、膚缺損，觀察治療效果與成活后的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 研究方法： 1、采用貼壁分離方法從脂肪抽吸液中分離出脂肪干細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增。在表皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞定向分化。分別檢測(cè)誘導(dǎo)前、后細(xì)胞的表面抗原表型，細(xì)胞周期與CK5、CK10、CK19表達(dá)情況，并繪制細(xì)胞增殖曲線。在成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)一步誘導(dǎo)ADSCs源表皮細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化，對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行ALP染色和Von Kossa染色檢查。

3、 2、掃描電鏡下觀察人脫細(xì)胞真皮的超微結(jié)構(gòu)。應(yīng)用人ADSCs源類表皮干細(xì)胞復(fù)合人脫細(xì)胞真皮體外構(gòu)建組織工程皮膚，對(duì)其進(jìn)行組織學(xué)觀察與超微結(jié)構(gòu)觀察。 3、應(yīng)用組織工程皮膚和脫細(xì)胞真皮修復(fù)裸鼠皮膚缺損，術(shù)后觀察皮膚缺損修復(fù)情況，對(duì)移植成活的組織工程皮膚進(jìn)行基底膜糖原(PAS)染色檢查和組織學(xué)觀察，對(duì)DAPI標(biāo)記的人ADSCs源類表皮干細(xì)胞進(jìn)行示蹤觀察。 4、應(yīng)用實(shí)驗(yàn)豬自體ADSCs源類表皮干細(xì)胞復(fù)合豬脫細(xì)胞真皮構(gòu)建

4、組織工程皮膚，修復(fù)其背部正中線左側(cè)皮膚缺損。以豬脫細(xì)胞真皮修復(fù)右側(cè)皮膚缺損做為對(duì)照。術(shù)后觀察皮膚缺損修復(fù)情況，對(duì)移植成活的組織工程皮膚進(jìn)行組織學(xué)觀察和超微結(jié)構(gòu)觀察。 研究結(jié)果： 1、ADSCs向表皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化，72小時(shí)后部分細(xì)胞由梭形變成圓形或橢圓形，7天后大部分細(xì)胞呈圓形或橢圓形，排列成鋪路石狀。誘導(dǎo)培養(yǎng)前、后的細(xì)胞增殖曲線均呈S型，但是誘導(dǎo)培養(yǎng)前ADSCs 7d時(shí)增殖達(dá)到頂峰，誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞6d時(shí)增殖達(dá)到頂峰。誘

5、導(dǎo)培養(yǎng)前87.42％的細(xì)胞處于G<,0>和G<,1>期，誘導(dǎo)培養(yǎng)后96.38％的細(xì)胞處于G<,0>和G<,1>期。誘導(dǎo)培養(yǎng)后，少數(shù)細(xì)胞CK5免疫熒光染色呈陽(yáng)性，部分細(xì)胞CK19免疫熒光染色呈陽(yáng)性，CK19在mRNA水平的表達(dá)呈陽(yáng)性。誘導(dǎo)培養(yǎng)后傳代lO次的細(xì)胞CKlO、CKl9在mRNA水平的表達(dá)呈陽(yáng)性。誘導(dǎo)培養(yǎng)后傳代10次的細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，X-Gal染色呈陰性，細(xì)胞染色體數(shù)目2n=46，核型為女性正常核型(46，xx)。裸鼠皮下注射

6、誘導(dǎo)培養(yǎng)后傳代10次的細(xì)胞，2個(gè)月后無(wú)瘤體形成。ADSCs源表皮細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，ALP染色和Von Kossa染色顯示為陽(yáng)性。 2、人脫細(xì)胞真皮基底膜面與真皮面均為多孔結(jié)構(gòu)，基底膜孔隙直徑為31.03～82.76um(51.72±15.64um)，真皮孔隙直徑為115.38～192.31um(143.27±23.95tum)。對(duì)體外培養(yǎng)3天的組織工程皮膚進(jìn)行掃描電鏡觀察，可見大量人ADSCs源類表皮干細(xì)胞粘附于脫細(xì)胞真

7、皮基底膜上，細(xì)胞呈圓形、橢圓形，直徑為75.62～107.86tlm(87.11±11.46um)，顯著小于脫細(xì)胞真皮基底膜孔隙直徑。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)2周的組織工程皮膚與正常皮膚的組織結(jié)構(gòu)特征相似，僅缺少角質(zhì)層。 3、術(shù)后1個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組裸鼠背部移植的組織工程皮膚成活良好，但表皮較薄弱，色澤與周圍正常皮膚相似。PAS染色可見表皮層和真皮層之間有呈深紅染色、呈波浪狀連續(xù)存在的基底膜。術(shù)后2個(gè)月，光鏡下可見組織工程皮膚的結(jié)構(gòu)與

8、正常皮膚相似，真皮內(nèi)無(wú)表皮樣囊腫。應(yīng)用DAPI標(biāo)記人ADSCs源類表皮干細(xì)胞進(jìn)行示蹤觀察，術(shù)后1個(gè)月可見表皮深層有2～3層較強(qiáng)熒光顯色的細(xì)胞，術(shù)后2個(gè)月可見表皮深層有5～6層較弱熒光顯色的細(xì)胞。對(duì)照組裸鼠術(shù)后1個(gè)月時(shí)背部創(chuàng)面未愈合，仍覆蓋薄層痂皮，創(chuàng)緣輕度收縮。 4、術(shù)后1個(gè)月，實(shí)驗(yàn)豬背部正中線左側(cè)移植的組織工程皮膚成活良好，表皮角化明顯，色素缺失；正中線右側(cè)移植的豬脫細(xì)胞真皮形成肉芽組織，局部結(jié)痂，創(chuàng)緣收縮明顯。組織學(xué)觀察可

9、見，實(shí)驗(yàn)側(cè)組織工程皮膚的結(jié)構(gòu)與正常皮膚相似，真皮內(nèi)無(wú)表皮樣囊腫，表皮層與真皮層之間可見呈犬牙交錯(cuò)樣相接的表皮突和真皮乳頭；對(duì)照側(cè)豬脫細(xì)胞真皮則轉(zhuǎn)化為肉芽組織，其表面無(wú)表皮層覆蓋。超微結(jié)構(gòu)觀察可見，在成活的組織工程皮膚基底膜與基底層細(xì)胞之間有半橋粒連接形成；表皮細(xì)胞的胞質(zhì)中有角蛋白絲，成束狀排列；相鄰的表皮細(xì)胞之間形成橋粒連接。 研究結(jié)論 1、ADSCs具有易于獲取，能夠在體外大規(guī)模培養(yǎng)和擴(kuò)增，性質(zhì)穩(wěn)定，多潛能分化，培養(yǎng)擴(kuò)

10、增不需要大量的血清等優(yōu)點(diǎn)，是組織工程研究中良好的種子細(xì)胞來(lái)源。 2、ADSCs在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中能夠向表皮細(xì)胞分化，部分細(xì)胞具備了表皮干細(xì)胞的一些特征，我們將其暫時(shí)命名為“ADSCs源類表皮干細(xì)胞”。ADSCs源類表皮干細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)能夠復(fù)層生長(zhǎng)，形成表皮樣結(jié)構(gòu)。 3、本研究中，誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞分化的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系具有安全性。 4、脫細(xì)胞真皮基底膜具有良好的細(xì)胞粘附性?；啄づc真皮均為多孔結(jié)構(gòu)，基

11、底膜和真皮的孔隙直徑接近于支架材料促進(jìn)表皮組織和真皮組織再生的最佳孔隙直徑。 5、脫細(xì)胞真皮的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有利于移植部位周圍的成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞移行進(jìn)入并增殖，體外構(gòu)建組織工程皮膚時(shí)不需在真皮層內(nèi)復(fù)合成纖維細(xì)胞。這既降低了構(gòu)建組織工程皮膚的復(fù)雜性和經(jīng)濟(jì)成本，同時(shí)還提高了安全性。 6、本研究中構(gòu)建的組織工程皮膚具有生物活性，移植于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)后能夠轉(zhuǎn)化為組織結(jié)構(gòu)合理的皮膚組織，未觀察到表皮樣囊腫形成。 7、本研究