IL-23-Th17與炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制關(guān)系探討.pdf

1、前言
　　炎癥性腸?。╥nflammatoryboweldisease，IBD）是一種復(fù)雜的多因素疾病，包括克羅恩病(Crohn'sdisease)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，UC)，是一組原因不明的腸道慢性非特異性炎癥，在美國其發(fā)病人數(shù)為1.4億，而歐洲國家為2.2億，在中國炎癥性腸病的發(fā)病率也在逐年上升。胃腸道是一個具有免疫屏障功能的器官，每克腸組織含有大約1011個細(xì)菌，包括至少395種不同的細(xì)菌種屬

2、和食物抗原，刺激粘膜免疫系統(tǒng)。雖然有這些潛在的免疫原，正常的胃腸道幾乎很少發(fā)生炎癥，結(jié)腸上皮的屏障功能抑制腸道常駐菌介導(dǎo)的炎癥，表達(dá)抑菌多肽，這些功能有助于維持胃腸道的穩(wěn)態(tài)。IBD的發(fā)病與許多不同的因素有關(guān)，包括常駐菌群、上皮屏障功能或免疫應(yīng)答失調(diào)。雖然宿主與環(huán)境因素均可導(dǎo)致炎癥性腸病的發(fā)生，大量的臨床和實驗研究發(fā)現(xiàn)腸道穩(wěn)態(tài)失衡以及針對自身腸道菌群出現(xiàn)異常的免疫反應(yīng)是炎癥性腸病發(fā)病的主要原因。目前大量的基礎(chǔ)和臨床研究認(rèn)為Th1/Th2在

3、IBD的發(fā)病中起到重要的作用，但是仍有一些問題不能得到滿意的解釋。
　　本實驗采用2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid，TNBS）灌腸誘導(dǎo)BALB/C小鼠建立炎癥性腸病動物模型，體外培養(yǎng)小鼠的腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞，采用多種方法檢測不同組織在不同時間段IL-23，IL-17，TNF-α和IFN-γ的表達(dá)水平，將抗IL-23p19抗體腹腔注射治療炎癥性腸病模型小鼠，臨床癥

4、狀改善，炎癥因子表達(dá)水平下降。本實驗結(jié)果能夠初步證實IL-23/Th17免疫軸參與炎癥性腸病的發(fā)生，而且疾病的嚴(yán)重性與Th17細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，抗IL-23p19抗體能夠有效治療炎癥性腸病。
　　材料和方法
　　一、材料
　　雄性BALB/C小鼠，SPF級，周齡8～10WK，體重22～25g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，室內(nèi)溫度20±2℃，相對濕度為50％，自然光線采光，日照時間為12小時，常規(guī)飲水，普通專用飼料

5、喂養(yǎng)。
　　二、主要試劑
　　2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)（美國sigma公司）;IL-23和IL-17免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供，即用型SABC免疫組化染色試劑盒;細(xì)胞凋亡檢測試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供;流式染色的試劑:PE標(biāo)記的抗IL-17(PE-IL-17)，APC標(biāo)記的抗IL-23(APC-IL-23)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗IFN-γ(FITC-IFN-γ)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗CD4

6、(FITC-CD4)，PE標(biāo)記的抗CD4(PE-CD4)，均購于美國BD/Pharmingen公司;ELISA試劑盒（IL-17，TNF-α，IFN-γ），購于上海森雄科技實業(yè)有限公司;SYBRPrimeScriptReal-TimePCRKit(TakaRa，DRR063s，大連寶生物工程有限公司);目的基因和內(nèi)參引物DNA，（TakaRaCustomDNA，由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計）;細(xì)胞因子IL-6、TGF-β和rIL-2

7、3購于美國R&D公司;抗IL-23p19抗體，購于Biolegend公司;PRMI-1640培養(yǎng)基，10％胎牛血清，購于Hyclone公司。
　　三、主要儀器和設(shè)備
　　倒置顯微鏡;低溫高速離心機(jī)(Eppendof);超低溫冰箱;超凈工作臺;流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，BDBioscience);全自動ELISA分析儀(BioTek，ELx808);LightCyclerRealTimePCR擴(kuò)增儀(Roche)

8、r>　　四、實驗方法
　?。ㄒ唬┙ALB/C小鼠炎癥性腸病模型
　　用5％TNBS/乙醇溶液灌腸，將抗IL-23p19抗體腹腔注射到模型小鼠的體內(nèi)，觀察治療前后小鼠一般情況的變化（包括腹瀉、血便、體重），用HE染色鑒定小鼠結(jié)腸上皮的炎癥改變。
　　（二）免疫組織化學(xué)
　　用免疫組化的方法檢測造模前后小鼠結(jié)腸組織中IL-23和IL-17的表達(dá)，用凋亡試劑盒檢測治療前后小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡，實驗操作按照試劑盒說

9、明。
　?。ㄈ┬∈竽c系膜淋巴結(jié)細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞的制備
　　將小鼠處死后分別取出脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，通過機(jī)械研磨的方法制成單細(xì)胞懸液，PBS清洗，離心，取少許細(xì)胞懸液計數(shù)及活性測定。
　?。ㄋ模w外培養(yǎng)小鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞
　　1、配制培養(yǎng)基:改良型RPMI-164090ml+10％胎牛血清10ml+慶大霉素4000u，其中RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清已經(jīng)過滅菌處理。
　　2、取24孔培養(yǎng)

10、板，每孔加入培養(yǎng)基1ml，然后分別加入脾淋巴細(xì)胞和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞，250μl/孔，約含有105個細(xì)胞，充分混勻。
　　3、根據(jù)實驗的需要單純培養(yǎng)或加入不同的刺激因子混合培養(yǎng)。
　　4、將培養(yǎng)板置于37℃CO2溫箱中孵育48小時。
　　5、每孔取上清液約200μl，移入EP管中，-70℃保存。
　?。ㄎ澹┝魇郊?xì)胞術(shù)
　　將培養(yǎng)48小時的腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4，IL-23，IL-1

11、7和IFN-γ的表達(dá)，實驗操作按照試劑盒說明。
　?。〦LISA
　　培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-23，IL-17，TNF-α和IFN-γ的含量用ELISA法檢測，實驗操作按照試劑盒說明。
　　（七）Real-TimePCR
　　不同組織（結(jié)腸組織、腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞）在不同時間段IL-23，IL-17，TNF-α和IFN-γ的表達(dá)用Real-TimePCR的方法檢測，實驗操作按照試劑盒說明。

12、　?。ò耍┙y(tǒng)計分析
　　所有數(shù)據(jù)采用Mean±SD來表示，計算采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，比較采用獨立樣本的t檢驗，p＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗結(jié)果
　　1、TNBS可以成功誘導(dǎo)出炎癥性腸病動物模型
　　2、模型小鼠結(jié)腸組織中IL-23和IL-17的表達(dá)明顯增加
　　3、與對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸粘膜和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞中IL-23、IL-17和TNF-α的表達(dá)明顯增加，以造模后第3天的表

13、達(dá)為最高，其中IL-23的表達(dá)要高于IL-17，但在脾淋巴細(xì)胞中這三種炎癥因子的表達(dá)水平與對照組相似。
　　4、與對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸粘膜和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞中IFN-γ幾乎不表達(dá)，但在造模后第7天的脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ呈高水平表達(dá)。
　　5、抗IL-23p19抗體可以有效改善炎癥性腸病動物模型的癥狀，治療后結(jié)腸粘膜凋亡小體的數(shù)量減少，IL-23、IL-17和TNF-α的表達(dá)下降，對IFN-γ的表達(dá)幾乎沒有影響。

14、>　　6、分離造模后第三天的小鼠腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞，將其分組與多種刺激因子共同體外培養(yǎng)，其中加入IL-6、TGF-β和rIL-23組的IL-23、IL-17和TNF-α的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于加入rIL-23組，加入抗IL-23p19抗體組的IL-23、IL-17和TNF-α的表達(dá)水平最低。
　　討論
　　炎癥性腸病（inflammatoryboweldiseases，IBD）是一種復(fù)雜的多因素疾病，包括克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎

15、(UC)，是一組原因不明的腸道慢性非特異性炎癥，目前的觀點認(rèn)為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)識別腸道常駐菌群或者固有免疫系統(tǒng)與腸道常駐菌群發(fā)生異常的免疫反應(yīng)在炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。在免疫反應(yīng)中CD4+T細(xì)胞作為輔助性T細(xì)胞，協(xié)助其他炎性細(xì)胞發(fā)揮各種效應(yīng)功能，啟動免疫應(yīng)答。幼稚T細(xì)胞在接受特定信號刺激下可以分化成為不同類型的輔助性T細(xì)胞，目前主要是Th1、Th2、Th17和Treg這四種T細(xì)胞亞群，每種T細(xì)胞亞群分泌不同的細(xì)胞因子，使其在適應(yīng)

16、性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。Th1細(xì)胞分泌高水平的IFN-γ以清除胞內(nèi)病原體;Th2細(xì)胞表達(dá)IL-4，IL-5和IL-13有利于宿主清除寄生蟲和蠕蟲感染;Treg分泌TGF-β和/或IL-10，抑制輔助性T細(xì)胞增殖及其功能，以維持免疫穩(wěn)態(tài)或下調(diào)感染后的免疫應(yīng)答，輔助性T細(xì)胞功能失調(diào)后可以浸潤IBD的胃腸道。隨著研究的深入，最近人們發(fā)現(xiàn)了IL-17細(xì)胞因子家族，以及IL-23介導(dǎo)的分泌IL-17的T細(xì)胞擴(kuò)增，這組不同的T細(xì)胞亞群被命名為Th

17、17細(xì)胞亞群，目前研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞與許多自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)。
　　本實驗采用5％TNBS/無水乙醇（按體積比為1∶1）灌腸，誘導(dǎo)BALB/C小鼠建立炎癥性腸病動物模型，該模型的機(jī)制是乙醇破壞腸粘膜屏障，TNBS作為一種有機(jī)酸半抗原滲入結(jié)腸組織，與組織蛋白等高分子物質(zhì)結(jié)合，形成全抗原，使T淋巴細(xì)胞致敏，導(dǎo)致一系列免疫反應(yīng)。實驗組小鼠灌腸后1分鐘左右即出現(xiàn)腹瀉(65％)，表現(xiàn)為血性稀便(45％)，腹式呼吸，伏臥，不動，不覓食

18、，個別小鼠出現(xiàn)抽搐，死亡率55％，24小時后小鼠狀態(tài)開始好轉(zhuǎn)，有活動和覓食，血便（包括便潛血陽性）持續(xù)一周左右（主要集中在前四天），到第七天基本恢復(fù)正常。體重下降出現(xiàn)在第一周，實驗組小鼠造模后第三天體重是造模前的82.95％，p＜0.05，對照組小鼠灌腸后第三天體重是原來的95.19％，p＞0.05;實驗組小鼠造模后第五天體重是造模前的90.64％，與造模后第一天的體重接近，對照組小鼠灌腸后第五天體重是原來的109.52％，較灌腸后第一

19、天增加。分析以上的實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)模型組小鼠造模后第三天的DAI最高，p＜0.05，同時體重下降的百分比也最多p＜0.05，因此TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎動物模型為急性腸道炎癥，炎癥持續(xù)時間為一周，但以第三天為最嚴(yán)重。光學(xué)顯微鏡下炎癥累及粘膜和粘膜下層，重者可深達(dá)肌層，表現(xiàn)為粘膜充血、水腫、出血，上皮脫落、壞死、潰瘍形成，粘膜和粘膜下層毛細(xì)血管擴(kuò)張，有炎癥細(xì)胞浸澗。小鼠結(jié)腸粘膜的病理表現(xiàn)與DAI評分和體重變化相一致。由此可見TNBS/乙醇灌腸可以

20、成功誘導(dǎo)IBD動物模型，該模型屬于Th1細(xì)胞介導(dǎo)的腸道免疫反應(yīng)，其病理特征類似于人類克羅恩病。此模型特異性高，重復(fù)性好，已經(jīng)引起學(xué)者的廣泛關(guān)注，成為目前誘導(dǎo)克羅恩病模型的主要方法。
　　我們通過多種方法(包括免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA和RT-PCR)檢測小鼠結(jié)腸粘膜、脾淋巴細(xì)胞和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞在造模后第1、3、5、7天IL-23、IL-17和IFN-γ的表達(dá)，模型組小鼠結(jié)腸粘膜和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞中IL-23和IL-17的表

21、達(dá)均高于對照組，p＜0.05，在造模后第三天表達(dá)最高，p＜0.05，而且結(jié)腸粘膜中IL-23和IL-17的表達(dá)要高于腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞，p＜0.05;而模型組小鼠結(jié)腸粘膜和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞中IFN-γ的表達(dá)與對照組相比無明顯差別，p＞0.05。模型組脾淋巴細(xì)胞中IL-23和IL-17的表達(dá)與對照組相比無明顯差別，p＞0.05，而模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞中IFN-γ的表達(dá)在造模后第七天才開始升高，p＜0.05;而模型組小鼠結(jié)腸粘膜和腸系膜淋巴結(jié)

22、細(xì)胞中IFN-γ的表達(dá)與對照組相比無明顯差別，p＞0.05?？笽L-23p19抗體可以有效地改善模型小鼠的狀態(tài)，腹瀉和血便減輕，體重下降的程度較治療前減輕，而且治療后模型小鼠結(jié)腸粘膜中IL-23和IL-17的表達(dá)明顯下降，凋亡小體的數(shù)量減少。上述實驗結(jié)果說明了Th17細(xì)胞在炎癥的早期病變局部表達(dá)增加，隨著疾病的進(jìn)展，Th1細(xì)胞占優(yōu)勢，在清除病原體的同時也帶來了炎癥反應(yīng)。將抗IL-23p19抗體腹腔注射治療炎癥性腸病模型小鼠，臨床癥狀改善

23、，炎癥因子表達(dá)水平下降。在體外培養(yǎng)造模后第3天的腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞時施加一些干預(yù)因素，證實了IL-6和TGF-β是Th17細(xì)胞分化所必需的，IL-23不直接促進(jìn)Th17細(xì)胞亞群的分化，但對已分化的Th17細(xì)胞起作用，參與炎癥介質(zhì)的級聯(lián)放大，使IL-17和TNF-α表達(dá)增加，其中以表達(dá)IL-17為主，進(jìn)一步證實了TNBS誘導(dǎo)的炎癥性腸病與Th17細(xì)胞亞群密切相關(guān)。另外體外實驗發(fā)現(xiàn)IL-23與Th17細(xì)胞共同培養(yǎng)能夠維持這些細(xì)胞的表型，在IL

24、-23缺失的情況下Th17細(xì)胞數(shù)量減少，這說明IL-23可能參與維持并穩(wěn)定Th17應(yīng)答。
　　結(jié)論
　　1、IL-23僅在TNBS致小鼠炎癥性腸病動物模型的炎癥局部高水平表達(dá)，對全身免疫系統(tǒng)沒有影響;
　　2、Th17細(xì)胞在炎癥的早期發(fā)揮作用，Th1細(xì)胞可以維持炎癥的發(fā)生發(fā)展;
　　3、體外實驗證實，IL-6和TGF-B是誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分化成為Th17細(xì)胞的必需因子，IL-23可以協(xié)同IL-6和TGF-β促進(jìn)