骨髓源神經(jīng)干細胞移植聯(lián)合GDNF治療脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、脊髓損傷是一種嚴(yán)重的傷病，其致殘率與致死率非常高。對于脊髓損傷的傳統(tǒng)治療方法有脊柱骨折脫位的復(fù)位固定、解除脊髓壓迫、對癥及康復(fù)治療。近年來，隨著神經(jīng)病理生理及神經(jīng)發(fā)育學(xué)研究的不斷深入，神經(jīng)組織細胞移植逐漸應(yīng)用于脊髓損傷的治療并取得了肯定的效果。神經(jīng)干細胞(Neuralstemcells，NSCs)特別是骨髓基質(zhì)細胞源性神經(jīng)干細胞分化調(diào)控和移植修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損害亦成為研究重點。 骨髓基質(zhì)細胞(Bonemarrowstroma

2、lcells，BMSCs)是骨髓細胞中除去造血干細胞之外的細胞部分，目前已證實骨髓基質(zhì)細胞在特定的培養(yǎng)條件下可分化成多種細胞，如間充質(zhì)細胞、成纖維細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞、內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞等，具有克隆樣增殖特性。其多潛能性的發(fā)現(xiàn)和向神經(jīng)細胞方向定向分化的成功，為神經(jīng)干細胞的來源增加了一個新的途徑，也為解決“自體源神經(jīng)干細胞”移植方案中細胞數(shù)量不足的問題提供了新的思路。 膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(

3、glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)是一種新型的神經(jīng)營養(yǎng)因子，屬于TGF-p超家族成員，于1993年由Lin等首先從大鼠B49細胞系的上清中分離純化得到。GDNF是目前為止發(fā)現(xiàn)的在體外支持運動神經(jīng)元生長最有效的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，不僅能挽救發(fā)育過程中運動神經(jīng)元的程序性死亡，還可以促進脊髓損傷后皮質(zhì)神經(jīng)元的存活。近年來發(fā)現(xiàn)，GDNF除了對中腦多巴胺能神經(jīng)元具有營養(yǎng)保護作用外，還對感覺神經(jīng)

4、元和運動神經(jīng)元有不同程度的營養(yǎng)保護作用。 本研究通過建立體外、體內(nèi)實驗?zāi)Ｐ偷仁侄?，對骨髓基質(zhì)細胞源性神經(jīng)干細胞(Bonemarrowstromalcells-derivedneuralstemcells，BMSCs-D-NSCs)的體外擴增、定向分化、移植及其所移植細胞在損傷脊髓內(nèi)的存活情況等進行研究，以進一步了解BMSCs-D-NSCs的生物學(xué)特性，并探討其在脊髓損傷應(yīng)用的可行性和有效性。 第一部分 BMSCs體外誘導(dǎo)

5、分化成神經(jīng)元樣細胞的實驗研究 目的： 研究SD大鼠BMSCs體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細胞的可行性。 材料及方法： 1.以SD大鼠為實驗對象，無菌條件下獲取大鼠骨髓，梯度密度離心獲取BMSCs。 2.在體外應(yīng)用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基(專利號：ZL02134314.4)和細胞因子進行BMSCs向神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元樣細胞的誘導(dǎo)分化。細胞培養(yǎng)中分別加入維甲酸(retinoicacid，RA)、膠質(zhì)細胞源性神

6、經(jīng)營養(yǎng)因子(Glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)等細胞因子。 3.CK2型倒置相差光學(xué)顯微鏡(OLYMPAS，JAPAN)追蹤觀察細胞生長情況并拍照；采用SABC法進行免疫細胞化學(xué)鑒定。 結(jié)果： 1.大鼠BMSCs能在體外培養(yǎng)中增殖分化為神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元樣細胞。培養(yǎng)

7、48小時后細胞有分裂現(xiàn)象，7d后可見細胞克隆團。12d后大而圓細胞有出芽，16～21d細胞進一步分化出長突起，大多數(shù)長突起細胞呈現(xiàn)出典型神經(jīng)元樣細胞，并交織成網(wǎng)。 2.經(jīng)免疫細胞化學(xué)鑒定，培養(yǎng)7～14d的神經(jīng)干細胞可特異性表達神經(jīng)巢蛋白(Nestin)；經(jīng)培養(yǎng)20d的神經(jīng)元樣細胞分別見成熟神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specificenolase，NSE)和神經(jīng)核蛋白(neuronspecificnuclearprote

8、in，NeuN)的表達。 結(jié)論： 大鼠BMSCs是具有較強的自我更新能力和多向分化潛能的細胞，在一定條件下，可分化為神經(jīng)干細胞并進一步分化為神經(jīng)元樣細胞，表達神經(jīng)組織細胞抗原。RA和GDNF在BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化的過程中起著積極作用。BMSCs可作為神經(jīng)干細胞的種子細胞。 第二部分 BMSCs-D-NSCs移植兼用GDNF修復(fù)脊髓損傷的實驗研究 目的： 研究BMSCs-D-NSCs移植兼用

9、GDNF對損傷脊髓的修復(fù)作用。 材料及方法： 1.用半橫斷法制作脊髓損傷動物模型； 2.將實驗動物分為4組：A組：單純脊髓損傷組；B組：脊髓損傷+GDNF組； C組：脊髓損傷+移植NSCs組；D組：脊髓損傷+移植NSCs十GDNF組； 另設(shè)假手術(shù)組以為正常對照。 3.以帶有綠色熒光蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs，進行移植細胞的追蹤觀察； 4.手術(shù)后應(yīng)用行為學(xué)(BASso，Beattie，

10、andBresnahanlocomotorratingscale，BBB評分)、組織形態(tài)學(xué)觀察損傷脊髓功能恢復(fù)情況；應(yīng)用免疫組化染色方法觀察不同組別脊髓損傷處的膠質(zhì)原性纖維酸性蛋白(Glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)和凋亡的動態(tài)變化情況； 5.熒光顯微鏡觀察移植細胞的存活狀況。 結(jié)果： 1.B組較A組脊髓損傷后GFAP表達降低、凋亡減少； 2.BMSCs-D-NSCs移植

11、可以在宿主脊髓中存活、發(fā)育、生長、分化并形成神經(jīng)連接，促進損傷脊髓功能恢復(fù)； 3.BBB評分顯示脊髓損傷功能恢復(fù)的水平：B、C、D組評分高于A組，B組和C組間無顯著差異；D組評分最高。 結(jié)論： GDNF能抑制脊髓損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)化和細胞凋亡；骨髓源神經(jīng)干細胞移植兼用神經(jīng)生長因子能維持神經(jīng)元的細胞形態(tài)，對成年大鼠損傷脊髓功能恢復(fù)有促進作用。NSCs移植與運用外源性GDNF對于促進成鼠損傷脊髓功能恢復(fù)具有協(xié)同效應(yīng)