RCP與頭頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后的相關(guān)性研究.pdf

1、第一章 RCP在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床病理意義
　　目的
　　檢測Rab coupling protein(RCP)mRNA及蛋白在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(頭頸鱗癌)組織、癌旁、癌前病變組織及細(xì)胞株中的表達(dá),并探索其表達(dá)與頭頸鱗癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。
　　方法
　　采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測RCP蛋白在95例頭頸鱗癌、16例癌旁組織及18例聲帶白斑石蠟組織標(biāo)本中的表達(dá),并統(tǒng)計分析RCP蛋白在頭頸鱗癌中的表

2、達(dá)水平與其臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系;另外,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測RCP mRNA在10對喉癌新鮮標(biāo)本及癌旁組織的表達(dá)水平;利用Western blot技術(shù)檢測RCP蛋白在NP-69(鼻咽部永生化細(xì)胞株)及頭頸鱗癌細(xì)胞株(Tu212、Tu686、M2、M4)中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　RCP mRNA在喉癌組織中表達(dá)明顯升高,而在癌旁組織中表達(dá)微弱,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;RCP蛋白在癌旁組織、聲帶白斑(癌前病變)及頭頸鱗

3、癌組織中表達(dá)呈梯形依次升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;RCP蛋白在頭頸鱗癌中的表達(dá)水平與頭頸鱗癌的T分期(P=0.028)、臨床分期(P=0.012)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.004)和腫瘤復(fù)發(fā)(P=0.016)密切相關(guān),而與患者年齡(P=0.383)、飲酒史(P=0.658)、抽煙史(P=0.811)、腫瘤類型(P=0.153)、分化程度(P=1.004)在統(tǒng)計學(xué)上無相關(guān)性;Kaplan-Meier生存分析顯示頭頸鱗癌患者RCP蛋白高表達(dá)組與低

4、表達(dá)組5年總生存率(Overall survival)分別為40％和75％,5年無病生存率(Disease-free survival)分別為30.7％和64％,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.05);多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析進一步顯示,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.037)、腫瘤復(fù)發(fā)(P=0.000)和RCP蛋白表達(dá)水平(P=0.016)均為頭頸鱗癌患者預(yù)后的獨立影響因素。
　　結(jié)論
　　RCP在頭頸鱗癌組織及細(xì)胞中高表達(dá),而

5、在癌旁組織及NP-69細(xì)胞株中表達(dá)較低,RCP可能與腫瘤的發(fā)生相關(guān);RCP蛋白在頭頸鱗癌中的表達(dá)水平與與頭頸鱗癌患者的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān),且RCP蛋白表達(dá)是頭頸鱗癌預(yù)后的獨立影響因素。這些結(jié)果均提示RCP在頭頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用,并對頭頸鱗癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有評估價值。
　　第二章 RCP對頭頸鱗癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響
　　目的
　　我們前期研究表明RCP蛋白在頭頸鱗癌組織中顯著上調(diào)

6、,并與頭頸鱗癌患者的臨床分期、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。因此,本部分將利用RNAi技術(shù)沉默RCP基因在頭頸鱗癌細(xì)胞株CNE-2中的表達(dá),并觀察RCP基因沉默后對頭頸鱗癌CNE-2細(xì)胞體外生長、遷移及侵襲能力等生物學(xué)行為的影響。
　　方法
　　利用慢病毒介導(dǎo)的RCP shRNA沉默頭頸鱗癌CNE-2細(xì)胞中RCP基因表達(dá),Western blot技術(shù)檢驗RCP基因的沉默效果;嘌呤霉素篩選,建立RCP基因穩(wěn)定沉默的CNE-2細(xì)胞株

7、;通過CCK-8法及平板克隆形成實驗檢測沉默RCP基因?qū)NE-2細(xì)胞增殖及克隆形成能力的影響;利用Transwell遷移侵襲實驗觀察RCP基因沉默后對CNE-2細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。
　　結(jié)果
　　慢病毒介導(dǎo)的RCP shRNA顯著抑制了CNE-2細(xì)胞中RCP基因的表達(dá)。利用嘌呤霉素對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進行篩選,成功建立了CNE-2RCPRNAi+(RCP基因穩(wěn)定沉默)和CNE-2RCPRNAi-(空白對照)細(xì)胞株;與正常對

8、照組CNE-2及空白對照組CNE-2RCPRNAi-細(xì)胞比較,RCP干擾組CNE-2RCPRNAi+細(xì)胞增殖能力及克隆形成能力顯著減弱。CCK-8實驗中通過對OD450測得數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),CNE-2RcPRNAi+與CNE-2、CNE-2RCPRNAi-三組細(xì)胞生長到第2、3,4,5,6,7天,CNE-2RCPRNAi+與其他兩組細(xì)胞的增殖能力差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),而CNE-2、CNE-2RCPRNAi-細(xì)胞增殖能力

9、無統(tǒng)計學(xué)差異;平板克隆形成實驗結(jié)果表明,CNE-2RCPRNAi+細(xì)胞克隆形成數(shù)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)為7.3±3.02,而CNE-2RcPRNAi-、CNE-2細(xì)胞克隆形成數(shù)(均數(shù)4-標(biāo)準(zhǔn)差)分別為18.0±3.43、20.1±4.09,獨立因素T檢驗提示和其他兩組相比,CNE-2RCPRNAi+克隆形成能力明顯減弱,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),而CNE-2RCPRNAi-和CNE-2在克隆形成數(shù)上無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);Tr

10、answell遷移實驗發(fā)現(xiàn)24小時后穿過Transwell小室聚碳酸酯膜的CNE-2RCPRNAi+細(xì)胞較兩對照組(CNE-2和CNE-2RCPRNAi-)明顯減少(173.67±8.08 vs277.33±8.74,260.67±10.02)(P＜0.01);Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)48小時后穿過Transwell小室Matrigel膠的CNE-2RCPRNAi+細(xì)胞較兩對照組(CNE-2和CNE-2RCPRNAi-)顯著減少(