大黃素甲醚對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.pdf

1、該研究在用線(xiàn)拴法堵塞大鼠大腦中動(dòng)脈,建立鼠腦缺血再灌注模型的基礎(chǔ)上,利用放射免疫及免疫組織化學(xué)技術(shù)定量分析炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和Caspase-3在腦缺血再灌注后的表達(dá)變化,以探討其對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用,以及大黃素甲醚對(duì)它們表達(dá)的影響,為臨床上大黃素甲醚的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù).1大黃素甲醚對(duì)大鼠腦缺血再灌注I L-1 β表達(dá)的影響目的:探討大黃素甲醚對(duì)大鼠腦缺血再灌注IL-

2、1 β表達(dá)的影響方法:成年健康雄性SD大鼠105只,隨機(jī)分為正常組∽o(hù)rm),假手術(shù)組(Sham)和缺血再灌注組(Model):分為再灌注6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)各時(shí)段組,藥物對(duì)照組(NS)、小劑量(大黃素甲醚20mg/kg)藥物治療組(LD)、大劑量(大黃素甲醚40mg/kg)藥物治療組(HD)且每組又分為腦缺血再灌注12小時(shí)、24小時(shí)兩組,每組均為7只.該研究采用線(xiàn)栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注模型,尼龍絲線(xiàn)經(jīng)右

3、側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈輕柔推進(jìn)阻塞大腦中動(dòng)脈,假手術(shù)組尼龍絲線(xiàn)進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈但不阻塞大腦中動(dòng)脈.藥物治療組于缺血前48小時(shí)、24小時(shí)、術(shù)前將大黃素甲醚溶于2ml生理鹽水鼻飼,藥物對(duì)照組則僅鼻飼等量生理鹽水.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭處死取右側(cè)大腦半球研成勻漿,采用放射免疫分析法測(cè)定腦組織中IL-1β的含量.結(jié)果:該實(shí)驗(yàn)局灶性腦缺血再灌注各個(gè)時(shí)間段腦組織IL-1 β含量明顯升高,經(jīng)單因素方差分析有顯著性差異(F=293.049,P<0.01),在時(shí)間和數(shù)值上保持一

4、致性,而且與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組和正常組比較有顯著性差異(P<0.01).再灌注6小時(shí)達(dá)高峰(1.295±0.0352ng/ml,與假手術(shù)組比較P<0.01),隨之開(kāi)始下降,在腦缺血再灌注48小時(shí)(0.9030±0.0212 ng/ml,P<0.01)仍處于較高的水平,假手術(shù)組和正常組比較沒(méi)有顯著性差異(P>0.05).大黃素甲醚治療組與相應(yīng)的藥物對(duì)照組比較病變側(cè)腦組織IL-1β含量降低,大劑量治療各組及小劑量治療組腦缺血再灌注12小時(shí)

5、有顯著性差異(P<0.01).結(jié)論:IL-1β在腦缺血再灌注損傷中起重要作用,大黃素甲醚通過(guò)抑制腦缺血再灌注IL-1β的表達(dá),減輕腦缺血再灌注損傷.2大黃素甲醚對(duì)大鼠腦缺血再灌注I CAM-1和Caspase-3表達(dá)的影響目的:探討大黃素甲醚對(duì)大鼠腦缺血再灌注ICAM-1和Caspase-3表達(dá)的影響方法:成年健康雄性SD大鼠105只,隨機(jī)分為正常組,假手術(shù)組:分為再灌注6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)各時(shí)段組,缺血再灌注組:分為再

6、灌注6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)各時(shí)段組,藥物對(duì)照組、小劑量藥物治療組(大黃素甲醚20mg/kg)、大劑量藥物治療組(大黃素甲醚40mg/kg)且每組又分為腦缺血再灌注12小時(shí)、24小時(shí)兩組,每組均為7只.該研究采用線(xiàn)栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注模型,尼龍絲線(xiàn)經(jīng)右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈輕柔推進(jìn)阻塞大腦中動(dòng)脈,假手術(shù)組尼龍絲線(xiàn)進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈但不阻塞大腦中動(dòng)脈.藥物治療組于缺血前48小時(shí)、24小時(shí)、術(shù)前將大黃素甲醚溶于2ml生理鹽水鼻飼

7、.藥物對(duì)照組則僅鼻飼等量生理鹽水.實(shí)驗(yàn)結(jié)束取材,石蠟包埋,常規(guī)切片,HE染色和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)ICAM-1和Caspase-3蛋白表達(dá).電鏡標(biāo)本用2.5％戊二醛固定,鋨酸后固定,樹(shù)脂包埋,超薄切片,電鏡觀(guān)察并拍片.結(jié)果:(1)光鏡(HE染色):腦缺血再灌注各組均可見(jiàn)皮質(zhì)和紋狀體區(qū)出現(xiàn)細(xì)胞腫脹,胞漿嗜酸性變,細(xì)胞間隙增大,胞核碎裂、溶解、固縮,淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),以再灌注24小時(shí)上述變化明顯.假手術(shù)組和正常組未見(jiàn)異常變化.大黃素

8、甲醚治療組上述變化減輕.假手術(shù)組和正常組未見(jiàn)異常變化.(2)電鏡:模型組神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)高度水腫,細(xì)胞器稀疏散在,電子密度減低,線(xiàn)粒體高度水腫,大部分嵴排列紊亂或消失,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張脫顆粒,部分神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)核染色質(zhì)邊集;正常組神經(jīng)元核膜圓形,規(guī)整,核仁大而明顯,胞漿內(nèi)可見(jiàn)各種細(xì)胞器,電子密度均一,細(xì)胞形態(tài)正常.(3)免疫組化結(jié)果:①I(mǎi)CAM-1:腦缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)病變側(cè)蛋白表達(dá)明顯增高,積分光密度值(F=15.707)和面密度值(F=1

9、8.343)經(jīng)單因素方差分析有顯著性差異(P<0.01),在時(shí)間上和數(shù)值上保持一致性,而且與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)各組和正常組比較有顯著性差異(P<0.01).腦缺血再灌注24小時(shí)達(dá)高峰(積分光密度值31.89±4.38,面密度值0.01 85±0.0031),腦缺血再灌注48小時(shí)仍持續(xù)高水平表達(dá).大黃素甲醚治療組各組蛋白表達(dá)的積分光密度和面密度較同時(shí)段藥物對(duì)照組降低,且有顯著性差異(P<0.05或P<0.01).②Caspase-3:腦缺

10、血再灌注各時(shí)間點(diǎn)病變側(cè)蛋白表達(dá)明顯增高,積分光密度值(F=8.272)和面密度值(F=329.894)經(jīng)單因素方差分析有顯著性差異(P<0.01),在時(shí)間上和數(shù)值上保持一致性,而且與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)各組和正常組比較有顯著性差異(P<0.05或P<0.01).腦缺血再灌注24小時(shí)達(dá)高峰(積分光密度值15.44±3.38,面密度值0.01150±0.00035),腦缺血再灌注48小時(shí)仍持續(xù)高水平表達(dá).大黃素甲醚治療組各組蛋白表達(dá)的積分光密

11、度和面密度較同時(shí)段藥物對(duì)照組降低,大劑量治療各組有顯著性差異(P<0.05或P<0.01).結(jié)論:腦缺血再灌注后ICAM-1和Caspase-3表達(dá)明顯升高,與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān).大黃素甲醚通過(guò)抑制腦缺血再灌注后ICAM-1和Caspase-3表達(dá),減輕再灌注損傷,起到腦保護(hù)作用.結(jié)論1.大黃素甲醚可通過(guò)血腦屏障,具有很強(qiáng)的抗炎作用.該實(shí)驗(yàn)證實(shí),大黃素甲醚在腦缺血再灌注早期即可拮抗缺血腦組織中IL-1β的合成和分泌,從而減輕IL-

12、1β所引起的一系列腦缺血損害,是治療缺血性腦血管病再灌注損傷的重要途徑.2.大黃素甲醚可下調(diào)腦缺血再灌注病變側(cè)神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá),減輕其所介導(dǎo)的白細(xì)胞粘附和浸潤(rùn),從而抑制腦缺血再灌注后腦組織的炎性反應(yīng),減輕腦組織再灌注損傷.3.半胱氨酸蛋白酶Caspase-3參與了腦缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,該實(shí)驗(yàn)證實(shí),半暗帶區(qū)Caspase-3激活、神經(jīng)細(xì)胞凋亡是一個(gè)延遲發(fā)生的過(guò)程,為臨床應(yīng)用有效的治療藥物提供了寶貴的時(shí)間窗.4.