青藤堿關(guān)節(jié)腔注射對骨關(guān)節(jié)炎兔細(xì)胞因子及軟骨結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、目的及意義： 骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是一種關(guān)節(jié)軟骨退變和關(guān)節(jié)周圍形成骨質(zhì)增生為病理特征的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病，是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一，是導(dǎo)致50歲以上人群功能殘疾、造成經(jīng)濟(jì)損失和影響社會發(fā)展的主要疾病之一。國內(nèi)統(tǒng)計資料表明，我國患有OA的人數(shù)占總?cè)丝诘?％，其中大部分為膝OA，55歲人群以上X線上有膝OA表現(xiàn)者約60％，65 歲以上老年人X線上有膝OA的發(fā)病率可達(dá)85％，目前我國正在步入人口老齡化國家的行列，因而OA的發(fā)病

2、率將有增無減，可見其影響巨大，正因為如此目前該病正成為大家關(guān)注的熱點。 骨關(guān)節(jié)炎的治療目標(biāo)是控制疼痛、改善關(guān)節(jié)功能和生活質(zhì)量，抑制疾病的進(jìn)程，盡可能避免治療的毒副作用。西醫(yī)學(xué)根據(jù)OA的發(fā)病機(jī)理，研究了許多新型藥物及方法治療OA，并取得顯著進(jìn)展，同時提出了今后研究策略。目前在OA的治療方面對抑制整個疾病的進(jìn)程的藥物(如補(bǔ)充軟骨基質(zhì)成分的氨基葡萄糖、IL-1 抑制劑雙醋瑞因、有提高滑液質(zhì)量并保護(hù)軟骨的透明質(zhì)酸)的研究較多，但是因為價

3、格均較貴、起效也較慢而限制了它們的應(yīng)用。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨性關(guān)節(jié)炎屬于“痹證”、“骨痹”范疇?！端貑枴け哉摗吩唬骸帮L(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也。五臟皆有合，病久而不去者，內(nèi)舍于其合也。故骨痹不已，復(fù)感于邪，內(nèi)舍于腎。”風(fēng)寒濕邪侵襲及跌仆扭傷為發(fā)病誘因，肝腎虧虛是本病發(fā)病基礎(chǔ)，也是疾病繼續(xù)發(fā)展的結(jié)果，故本病的治則：祛風(fēng)散寒除濕止痛，補(bǔ)益肝腎。青風(fēng)藤為防已科植物青藤的干燥根莖，苦、辛、平稍偏溫。中醫(yī)藥學(xué)應(yīng)用青風(fēng)藤已有一千多年的歷史效果顯

4、著。清風(fēng)藤名稱始見于宋·《圖經(jīng)本草》，蘇頌頌曰：“生臺州天臺山中。其苗蔓延木上，四時常青。土人采莖用……，……治風(fēng)疾?！本哂徐铒L(fēng)散寒除濕、通絡(luò)止痛的作用。青風(fēng)藤的主要藥理成分為青藤堿，應(yīng)用體外酶反應(yīng)實驗體系，觀察青藤堿對離體環(huán)氧化酶-1(COX-1)和 COX-2純酶活性的影響，結(jié)果提示青藤堿選擇性抑制COX-2緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)所致的疼痛。也有研究顯示青風(fēng)藤能顯著增強(qiáng)小鼠非特異性免疫功能，抑制細(xì)胞免疫功能，但對體液免疫功能無明

5、顯影響。從細(xì)胞因子基因調(diào)控研究青藤堿抗炎抗風(fēng)濕作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)青藤堿能通過下調(diào)入外周血單個核細(xì)胞 IL-1β、IL-8 mR NA表達(dá)發(fā)揮對關(guān)節(jié)炎的治療作用，從而抑制 RA的發(fā)展進(jìn)程。目前對青藤堿的研究多集中在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎上，使用方法多為口服或肌肉注射，而對于在OA中的治療作用及作用機(jī)理的研究、以及對于軟骨細(xì)胞組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的改變尚未見報道。本研究擬應(yīng)用青藤堿注射液給予OA模型動物關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，通過檢測細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6、

6、TNF-α變化，以及OA關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的改變，探討青藤堿治療OA的可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用青藤堿防治OA尋找和奠定理論基礎(chǔ)。 實驗方法： 本實驗擬應(yīng)用管型石膏固定制動方法對42只健康日本大耳白兔進(jìn)行OA造模，將36只模型兔分為3組：青藤堿關(guān)節(jié)腔注射治療組、透明質(zhì)酸組即施沛特關(guān)節(jié)腔注射對照組、生理鹽水關(guān)節(jié)腔注射組即模型組、另外4只健康兔作為正常對照組不給予任何處理。觀察青藤堿關(guān)節(jié)腔注射對OA兔血清及關(guān)節(jié)滑液中細(xì)胞因子

7、的影響以及對模型兔關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的改變的影響，探討青藤堿治療OA的作用機(jī)制。具體方法如下： 1、兔膝OA模型的建立：管型石膏固定兔左后肢關(guān)節(jié)，并在2、4、6周時用耳緣靜脈空氣栓塞法分別處死2只造模兔，觀察兔膝關(guān)節(jié)外觀及軟骨大體解剖結(jié)構(gòu)，通過肉眼觀察及按關(guān)節(jié)鏡下軟骨破壞分期標(biāo)準(zhǔn)判斷兔膝關(guān)節(jié)OA是否建立。 2、細(xì)胞因子的檢測：分別在1、2、3、4、5周各給予青藤堿、施沛特、生理鹽水0.2ml關(guān)節(jié)腔注射，在治療前及治

8、療5周后分別抽取靜脈血及膝關(guān)節(jié)滑液，作血清及膝關(guān)節(jié)滑液細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α檢測(試劑由上海西唐公司提供，嚴(yán)格按照試劑盒上要求進(jìn)行操作，IL-1β批號為0510132，IL-6批號為 0510094，TNF-α批號為 0510118)。 3、通過肉眼大體評分對各組實驗組兔關(guān)節(jié)軟骨病變的變化進(jìn)行觀察比較；通過光鏡對各組實驗前后組織形態(tài)學(xué)與組化雙染色(HE/safranin O雙染色)進(jìn)行觀察并按照調(diào)整后的關(guān)節(jié)軟骨

9、病變的組織學(xué)-組織化學(xué) Mankin’s評分進(jìn)行比較；透射電鏡觀察各組軟骨結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu)變化，并對各組進(jìn)行比較。 結(jié)果： 在成功建立兔膝 OA 模型的基礎(chǔ)上，分別給予OA兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射青藤堿、透明質(zhì)酸、生理鹽水，發(fā)現(xiàn)青藤堿及透明質(zhì)酸關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射前后血液及關(guān)節(jié)腔滑液中細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α均有明顯下降，治療組與對照組相比差異有顯著性。具體結(jié)果如下： 1、兔膝OA模型的建立：健康日本大耳白兔管型石膏

10、固定后，分別在2、4、6周時通過耳緣靜脈注射空氣法各處死2只兔，第2周時肉眼觀察發(fā)現(xiàn)兔膝關(guān)節(jié)面欠光滑平整，關(guān)節(jié)間隙尚正常、對稱、無軟骨下骨硬化和骨贅形成；第4周時觀察發(fā)現(xiàn)兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)間隙稍變窄，軟骨下骨輕度硬化，密度稍增高，未見明顯骨贅形成；第6周時拆除石膏可發(fā)現(xiàn)兔膝關(guān)節(jié)腫大變形，剖開膝關(guān)節(jié)可見典型OA表現(xiàn)，關(guān)節(jié)面不平整，內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)間隙狹窄，軟骨小潰瘍形成，軟骨下骨較硬化，有少許骨贅形成，光鏡組織形態(tài)學(xué)與組化染色觀察以及透射電鏡觀察均

11、符合OA的表現(xiàn)。 2、實驗前后細(xì)胞因子的變化：①青藤堿組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射前后血液中及關(guān)節(jié)滑液中細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α有明顯變化，同組間相比差異有顯著性(P<0.01=。②透明質(zhì)酸組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射前后血液中及關(guān)節(jié)滑液中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α有明顯變化，同組間相比差異有顯著性(P<0.05)。③生理鹽水組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射前后血液中及關(guān)節(jié)滑液中細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α無明顯變化，同組間相比

12、差異無顯著性(P>0.05)。④青藤堿組與透明質(zhì)酸組治療后血液中及關(guān)節(jié)滑液中細(xì)胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α有明顯變化，青藤堿組明顯優(yōu)于透明質(zhì)酸組，兩組間相比差異有顯著性(P<0.05)⑤青藤堿組組及透明質(zhì)酸組治療后血液中及關(guān)節(jié)滑液中細(xì)胞因子的變化與生理鹽水組相比均有明顯變化，差異有顯著性(P<0.01)。⑥青藤堿組、透明質(zhì)酸組、生理鹽水三組在治療后和正常D組相比差異均有顯著性(P值分別小于0.05、0.05、 0.01)

13、 3、關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)組織形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化： 1)肉眼大體評分：①治療組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射后肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨病變的大體評分與生理鹽水組相比有顯著性差異(P<0.05)②對照組關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨病變的大體評分與生理鹽水組相比有顯著性差異(P<0.05)③治療組與對照組治療后肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨病變的大體評分有日月顯變化，治療組明顯優(yōu)對照組，兩組間相比差異有顯著性(P<0.05)；④正常組與治療組、對照組及模型組三組相比差異有顯

14、著性(P<0.05、P<0.05、P<0.01)。 2)組織形態(tài)學(xué)與組化染色觀察：治療組關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)裂隙，可達(dá)切線層和過渡層，出現(xiàn)了細(xì)胞增生或輕度細(xì)胞克隆化形成的軟骨細(xì)胞簇，有多重潮線，safranin O 染色輕到中度的減少，與模型組相比Mankin’ s評分有顯著性差異。對照組關(guān)節(jié)軟骨的裂隙深入放射層，有細(xì)胞克隆化形成的軟骨細(xì)胞簇，或有細(xì)胞減少，有多重潮線和潮線被毛細(xì)血管穿破現(xiàn)象，safranin O 染色中到重度的減少，與

15、模型組相比Mankin’s評分有顯著性差異；模型組關(guān)節(jié)軟骨的裂隙可達(dá)鈣化層，甚至結(jié)構(gòu)被完全破壞，細(xì)胞減少，只殘留無細(xì)胞的 HE 紅染物質(zhì)，軟骨下骨增生，safranin O無染色，病變加重明顯；正常組關(guān)節(jié)軟骨表面大多完整，軟骨略顯蒼白，稍軟，鏡下見關(guān)節(jié)軟骨表面多光滑，細(xì)胞正常或有輕度增生，潮線多完整，safranin O染色均勻，與模型組相比Mankin’s評分有顯著性差異。 3)透射電鏡觀察：模型組呈顆粒狀外觀，交鏈現(xiàn)象不明顯

16、；細(xì)胞輪廓不清晰，胞核消失，細(xì)胞裂解為大量致密的顆粒狀物，有向陷窩一角聚集的傾向。正常組交鏈較為緊密，可見周期性橫紋；細(xì)胞呈梭形或橢圓形，胞核完整，核膜清晰，染色質(zhì)分布均勻，胞漿密度均勻或輕度增加，部分出現(xiàn)空泡，可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器。對照組交鏈出現(xiàn)紊亂；細(xì)胞縮小，胞核變形，有分離現(xiàn)象；胞膜出現(xiàn)不連續(xù)現(xiàn)象，胞漿丟失嚴(yán)重，可見大量脂滴或囊泡；胞周出現(xiàn)較多致密顆粒。治療組與治療前相比無明顯變化，介于對照組和正常組之間，交鏈出現(xiàn)輕度紊亂，

17、細(xì)胞縮小，胞核變形，核膜不很清晰，胞漿開始丟失。 研究結(jié)果表明，采用管形石膏制動的方法對健康、成年兔進(jìn)行膝OA造模，6周后兔膝關(guān)節(jié)就出現(xiàn)中重度的退變，具有造模時間短，操作簡單，可重復(fù)性強(qiáng)，動物死亡率低等特點，該方法沒有使用任何藥物也沒有其他可能對實驗有影響的因素，而且接近人類的發(fā)病過程，是一個比較好的OA的造摸方法。青藤堿關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對OA兔血液、關(guān)節(jié)滑液中的細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α有抑制作用，并且能夠抑制關(guān)節(jié)軟