禽波氏桿菌ompA-IgY Fc融合蛋白表達(dá)及松花粉多糖對(duì)雞體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目前對(duì)于一些傳染性疾病，滅活苗和活苗已被廣泛應(yīng)用，然而由于疫苗的滅活制備過程，使其抗原的物理及化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響了疫苗對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)能力。隨后，人們生產(chǎn)出的具有天然結(jié)構(gòu)和統(tǒng)一快速生產(chǎn)特性的重組亞單位疫苗也被廣泛用于預(yù)防各種傳染性疾病，然而，由于重組亞單位疫苗在機(jī)體的快速清除等影響，使得蛋白質(zhì)或多肽通常具有較短的血清半衰期及有限的抗原刺激。因此為了更有效的控制禽類傳染病，亟需開辟新的途徑，研發(fā)新型疫苗。近年來，將哺乳動(dòng)物免疫球蛋

2、白Fc與外源蛋白連接的融合技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)出來，這種技術(shù)中IgG Fc片段的連接賦予了融合的外源蛋白質(zhì)或多肽類似抗體的特性，不僅增強(qiáng)了對(duì)抗原捕獲的速度和效率，同時(shí)還增強(qiáng)了融合蛋白的血清半衰期。然而對(duì)于融合表達(dá)的IgY Fc是否與融合表達(dá)的IgG Fc一樣，可以有效促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體的非特異性免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答，目前還沒有被研究。
　　因次，在本項(xiàng)研究中，實(shí)驗(yàn)室以一種常見的可導(dǎo)致禽類呼吸道疾病的禽波氏桿菌（Borderella avi

3、um）中具有免疫原性的外膜蛋白A（ompA）為模型，使用巴斯德畢赤酵母GS115真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)連接有雞IgY Fc和禽波氏桿菌ompA的融合蛋白；首先檢測(cè)ompA-Fc融合蛋白對(duì)雞腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響，以評(píng)價(jià)連接的Fc對(duì)雞體非特異性免疫應(yīng)答的影響；再將融合蛋白免疫雛雞，以評(píng)價(jià)連接的Fc對(duì)特異性免疫應(yīng)答的影響；此外，本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)多年研究發(fā)現(xiàn)，泰山松花粉多糖(Taishan pinus massoniana pollen polysac

4、charide, TPPPS）作為一些滅活疫苗及亞單位疫苗的佐劑時(shí)表現(xiàn)出良好的免疫增強(qiáng)效果，因此，TPPPS作為一種免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)巨噬細(xì)胞的活化，以及用作佐劑對(duì)融合蛋白的免疫增強(qiáng)效果也被探究。
　　本研究分以下三部分內(nèi)容：
　　1. ompA-Fc融合蛋白畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建，表達(dá)及產(chǎn)物分析
　　對(duì)GenBank中公布的禽波氏桿菌ompA及雞IgY Fc基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物，以本實(shí)驗(yàn)室先前分離得到的禽波氏桿菌DNA

5、及本試驗(yàn)提取的雞脾臟RNA為模板，采用SOE-PCR的方法進(jìn)行重組基因的擴(kuò)增。隨后對(duì)擴(kuò)增后的重組基因連接轉(zhuǎn)化至pMD18-T克隆載體，同時(shí)基因測(cè)序鑒定重組克隆載體中重組基因序列，隨后利用限制性內(nèi)切酶Xho I和Not I對(duì)測(cè)序成功的重組克隆載體進(jìn)行雙酶切及產(chǎn)物膠回收，隨后將回收產(chǎn)物與經(jīng)相同酶酶切后的表達(dá)載體pPIC9再次進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。之后，將基因測(cè)序驗(yàn)證正確的重組表達(dá)質(zhì)粒線性化，并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)經(jīng)RDB板篩選的

6、陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定及基因測(cè)序。與此同時(shí)，以轉(zhuǎn)化的空質(zhì)粒pPIC9載體做為陰性對(duì)照。對(duì)經(jīng) PCR檢測(cè)正確的畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子及空質(zhì)粒對(duì)照分別進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)后的產(chǎn)物通過SDS-PAGE檢測(cè)分析，與蛋白凝膠層中陰性對(duì)照孔相比，在陽性孔中顯示有一條與目的蛋白分子量大小一致的約為47.4 kDa的條帶。畢赤酵母表達(dá)的融合蛋白在72 h獲得最大蛋白質(zhì)產(chǎn)量（18 mg/L）。隨后對(duì)表達(dá)的蛋白經(jīng)鎳柱進(jìn)行純化，并且SDS-PAGE檢測(cè)分析中

7、同樣檢測(cè)到一條大小約為47.4 kDa蛋白條帶。
　　分別用抗His標(biāo)簽抗體，大鼠抗omp多克隆抗體和兔抗雞IgG（HRP）進(jìn)行Western blot分析以確定表達(dá)后融合蛋白的免疫原性。在這三次獨(dú)立DAB顯色測(cè)定后，均觀察到一條大小約47.4 kDa的目的條帶；經(jīng)對(duì)照確定該條帶與之前在SDS-PAGE檢測(cè)的條帶分子量大小一致。結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白中IgY Fc和ompA保持其各自獨(dú)立的免疫原性。此外，本試驗(yàn)通過SWISS-M

8、ODEL軟件利用同源建模方法預(yù)測(cè)融合后ompA-Fc蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)融合蛋白中兩個(gè)蛋白在柔性肽的連接下分別進(jìn)行各自空間結(jié)構(gòu)的折疊相互不影響。此外，本實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建的pPIC9-ompA表達(dá)質(zhì)粒用作本研究中的陰性對(duì)照，此表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的ompA蛋白的免疫原性也進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　2. ompA-Fc融合蛋白與TPPPS對(duì)巨噬細(xì)胞活力影響試驗(yàn)
　　體外培養(yǎng)雞腹腔巨噬細(xì)胞， MTT法測(cè)定不同濃度的融合蛋白o(hù)mpA-Fc、omp

9、A及TPPPS對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性，以確定后續(xù)試驗(yàn)最佳使用劑量。之后分別將特定濃度的ompA-Fc-TPPPS、ompA-Fc、ompA和PBS與腹腔巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，中性紅試驗(yàn)檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞胞飲活性，Griess法、ELISA試劑盒分別檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞NO及TNF-α分泌能力，間接免疫熒光法檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)ompA吞噬能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞分泌MHC-II分子的能力。結(jié)果表明，ompA-Fc、ompA蛋白及TPPPS對(duì)腹腔

10、巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒性不明顯，并且TPPPS可劑量依賴性的增加細(xì)胞數(shù)量。同時(shí)，TPPPS也劑量依賴性的提高腹腔巨噬細(xì)胞胞飲、NO、TNF-α分泌能力。此外，連接的Fc及TPPPS佐劑也顯著提高了腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)ompA吞噬活性及MHC-II分子的表達(dá)。以上研究表明，連接IgY Fc的融合蛋白可有效提高腹腔巨噬細(xì)胞的活性，而TPPPS為一種有效巨噬細(xì)胞激活劑。
　　3. TPPPS對(duì)融合蛋白的免疫增強(qiáng)效果的研究
　　將本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)水提醇

11、沉法提取的泰山松花粉多糖與經(jīng)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)提取的融合蛋白o(hù)mpA-Fc、ompA等體積混合配比制備相應(yīng)疫苗，-80℃?zhèn)溆?。隨后對(duì)120只SPF雛雞隨機(jī)分成4組，之后分別在3、7、14 d后，對(duì)各組雛雞進(jìn)行頸部皮下接種0.2 mL ompA-Fc-TPPPS、ompA-Fc、ompA亞單位疫苗和PBS。隨后在首免后的第7、14、21、28、35、42、49 d，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)抽取3只雞進(jìn)行心臟采血收集樣品，以檢測(cè)其血清抗體效價(jià)，白細(xì)胞介

12、素-2、白細(xì)胞介素-4（IL-2、IL-4），外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞含量及T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。同時(shí)在三免后的1周后，對(duì)各組隨機(jī)抽取的20只雞攻毒，進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)測(cè)定（除對(duì)照組），期間連續(xù)7d對(duì)各組雞群臨床癥狀及保護(hù)率進(jìn)行觀察并記錄。試驗(yàn)結(jié)果表明，單純的ompA-Fc亞單位疫苗可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗ompA特異性抗體，分泌IL-2、IL-4，提高CD4+T、CD8+淋巴細(xì)胞百分含量和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，同時(shí)提供了近80％的動(dòng)物保護(hù)