端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子hTERT-U6嵌合啟動(dòng)子siRNA表達(dá)載體的腫瘤靶向性實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： RNAi技術(shù)在腫瘤基因治療方面的研究已較廣泛，但是siRNA不具有靶向惡性腫瘤細(xì)胞的能力，造成RNAi效應(yīng)的不確定性。端粒酶在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，正常細(xì)胞中除生殖細(xì)胞和造血細(xì)胞等外大多無或低表達(dá)[1]。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)是端粒酶活性的主要調(diào)控因素，對細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤的發(fā)生發(fā)展意義重大[2]。因此，本研究擬構(gòu)建端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)

2、子hTERT/U6嵌合啟動(dòng)子siRNA表達(dá)體系，研究該表達(dá)體系對hTERT表達(dá)不同的細(xì)胞株的沉默效應(yīng)，為探討基因的靶向治療奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.建立穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)的肝癌SMMC-7721細(xì)胞株和正常人成纖維細(xì)胞(HELF)細(xì)胞，供檢測轉(zhuǎn)染效率用。 2. 構(gòu)建兩條靶向EGFP基因的siRNA表達(dá)載體siRNA-EGFP-PTZU6+1，雙酶切鑒定及測序鑒定插入序列的正確性，轉(zhuǎn)入EGFP-7721

3、細(xì)胞中，RT-PCR、Western blot篩選出更好的siRNA-EGFP-PTZU6+1表達(dá)載體。 3.PCR擴(kuò)增hTERT啟動(dòng)子的核心片段，將插其入篩選出的siRNA-EGFP-PTZU6+1的U6啟動(dòng)子中，構(gòu)建靶向EGFP基因的hTERT/U6嵌合啟動(dòng)子(siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1)的siRNA表達(dá)載體，正向和反向插入各一個(gè)，測序鑒定其正確性。 4.將siRNA-EGFP-hTERT/U6-

4、PTZU6+1轉(zhuǎn)入EGFP-7721細(xì)胞株和EGFP-HELF細(xì)胞株中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測其抑制EGFP基因的表達(dá)效果，體外驗(yàn)證其有效性和靶向性。 結(jié)果： 1.酶切及測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了siRNA-EGFP-PTZU6+1表達(dá)載體， RT-PCR、 Western blot結(jié)果表明兩重組質(zhì)粒siRNA-EGFP-PTZU6+1轉(zhuǎn)染EGFP-7721細(xì)胞后，EGFP基因表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與

5、對照組相比均顯著抑制EGFP基因的表達(dá)(P＜0.01)。 2.測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1的表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入EGFP-7721細(xì)胞后，RT-PCR結(jié)果表明與對照組相比，反向插入的重組質(zhì)粒顯著抑制EGFP基因的表達(dá)(P＜0.01)。 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot結(jié)果表明，正向和反向siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EGFP-H

6、ELF細(xì)胞與空白質(zhì)粒比較，EGFP基因表達(dá)無差異(P＞0.05)。而轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的7721后，僅反向siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1重組質(zhì)粒抑制EGFP基因表達(dá)(P＜0.01)。siRNA-EGFP-PTZU6+1質(zhì)粒與空白質(zhì)粒組比較，在EGFP-7721和EGFP-HELF細(xì)胞株中，EGFP基因的表達(dá)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了siRNA-EGFP-hTE