柞蠶Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制基因克隆及表達特征分析.pdf

1、絲氨酸蛋白酶抑制劑（SPI）在生物體內(nèi)能與絲氨酸蛋白酶相互制約，調(diào)節(jié)絲氨酸和半胱氨酸酶的活性，調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶活性，形成一定的動態(tài)平衡，是一種調(diào)節(jié)劑，參與抗凝血、生殖、抑制過度自我吞噬、抗菌、免疫應(yīng)細胞分化、凋亡、組織重建及免疫等重要過程。絲氨酸蛋白酶抑制劑根據(jù)分子中的疏水中心、形成二硫鍵的架橋結(jié)構(gòu)、序列是否同源性相似和他們本身結(jié)構(gòu)的緊湊性主要分為Hinudim家族、Stefins家族、Cystatins家族、Cysteine prot

2、einase inhibitors家族及Squash seed inhibitors家族等，為一類蛋白超家族。
　　本研究基于前期柞蠶cDNA文庫獲得的部分序列設(shè)計引物利用RACE PCR方法克隆了柞蠶Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑(Kazal-type.KSPI), ApKTSPI基因的cDNA序列并進行序列分析，柞蠶ApKTSPI基因的cDNA全長568 bp，含54 bp5’非編碼區(qū)和223 bp3’非編碼區(qū)，開放閱讀框為2

3、91bp編碼96個氨基酸，含18個氨基酸（MKATTLIIFAVLFVAVNC）的信號肽和一個Kazal結(jié)構(gòu)域。和印度柞蠶親緣關(guān)系最近，其次親緣關(guān)系比較近的是羅奴霉素毛蟲（Lonomia obliqua），而與半翅目、雙翅目及鱗翅目昆蟲的親緣關(guān)系較遠。利用實時定量PCR檢測到ApKTSPI基因在柞蠶5齡幼蟲的脂肪體中特異性的高表達，其次是馬氏管，而在表皮、血細胞、絲腺和中腸中表達量相對較低。分別用柞蠶核型多角體病毒（NPV）、細菌（Es

4、cherichia coli）和真菌（Beauveria bassiana）3種不同的病原物免疫刺激柞蠶5齡幼蟲，利用實時定量PCR檢測到柞蠶5齡幼蟲脂肪體中ApKTSPI基因在核型多角體病毒（NPV）、大腸桿菌（E. coli）和白僵菌（B. bassiana）免疫刺激后表達量都能上調(diào)，但上調(diào)的程度和時間都不同。利用表達載體pET28a構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-ApKTSPI，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后利用IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PA