小麥Avenin-likeb蛋白對(duì)面筋強(qiáng)度影響效應(yīng)的研究.pdf

1、小麥高分子量麥谷蛋白亞基（HMW-GS）對(duì)加工品質(zhì)的影響已經(jīng)有較深入的研究，目前的研究結(jié)果較普遍認(rèn)為此類蛋白對(duì)加工品質(zhì)的影響主要是通過分子間二硫鍵實(shí)現(xiàn)的。為了更加深入的研究HMW-GS對(duì)面筋強(qiáng)度影響的分子機(jī)理，進(jìn)一步研究已有的HMW-GS（例如1Ax1）和發(fā)掘新的與品質(zhì)相關(guān)的基因是目前研究的熱點(diǎn)。
　　小麥Avenin-like b蛋白是一類新型的儲(chǔ)藏蛋白，含有18或19個(gè)半胱氨酸（Cys）殘基，預(yù)測(cè)可以形成分子間二硫鍵，從而影響

2、面粉的加工品質(zhì)，但目前該類蛋白的功能仍不清楚。為了研究該類蛋白對(duì)加工品質(zhì)的影響效應(yīng)，本研究構(gòu)建了胚乳特異性表達(dá)載體pLRPT-avel，通過基因槍轉(zhuǎn)化法將avenin-like b基因轉(zhuǎn)化到兩個(gè)不同品質(zhì)的小麥品種（鄭麥9023和鄂麥12）中，經(jīng)PCR、測(cè)序和Southern blotting證實(shí)獲得了轉(zhuǎn)基因植株。同時(shí)構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a-avel，實(shí)現(xiàn)了Avenin-like b蛋白在BL21(DE3)菌株中高效地表達(dá)，經(jīng)親

3、和層析技術(shù)獲得較高純度和濃度的重組目的蛋白，通過免疫日本大二白兔制備了小麥Avenin-like b蛋白的多克隆抗體。Western blotting結(jié)果證實(shí)在轉(zhuǎn)基因植株中，外源avenin-like b基因能夠穩(wěn)定地表達(dá)和遺傳。經(jīng)過連續(xù)五代（T0-T4）的篩選，從兩種遺傳背景的轉(zhuǎn)基因材中分別獲得了3株（鄭麥9023）和2株（鄂麥12）轉(zhuǎn)基因純合株系。對(duì)這些株系的SDS沉降值和面粉糅混特性分析顯示，過表達(dá)的Avenin-like b蛋白

4、提高了轉(zhuǎn)基因株系面粉的SDS沉降值體積、面團(tuán)彈性、耐揉性和抗延展性。由于不同轉(zhuǎn)基因株系中Avenin-like b蛋白表達(dá)量的不同，對(duì)面粉加工品質(zhì)造成的影響也不同，說明該類蛋白對(duì)面粉加工品質(zhì)的影響可能存在數(shù)量效應(yīng)。另外，過表達(dá)的Avenin-like b蛋白對(duì)兩種轉(zhuǎn)基因株系面粉加工品質(zhì)的影響趨勢(shì)是相同的，但改善中弱筋鄂麥12轉(zhuǎn)基因株系品質(zhì)的幅度比對(duì)中強(qiáng)筋鄭麥9023轉(zhuǎn)基因株系大。
　　利用SDS-PAGE和Western blot

5、ting分析小麥Avenin-like b蛋白在小麥種子中的存在形式，結(jié)果顯示該類蛋白主要以聚合體和寡聚體的形式存在，小部分以單體的形式存在。與對(duì)照株系相比，在轉(zhuǎn)基因株系中，聚合體蛋白中的Avenin-like b蛋白的含量明顯增加。進(jìn)一步用SE-HPLC證實(shí)轉(zhuǎn)基因植株面粉加工品質(zhì)的改善與聚合體蛋白比例的增加相關(guān)。
　　此外，對(duì)小麥HMW-GS1Ax1亞基基因進(jìn)行定點(diǎn)人工突變，實(shí)現(xiàn)與1Dx5亞基近N-端中間重復(fù)區(qū)同一氨基酸序列位點(diǎn)