HCMV原發(fā)持續(xù)性感染對(duì)BALB-c小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響.pdf

1、目的：建立人巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)原發(fā)感染BALB/c小鼠模型，觀察HCMV持續(xù)性感染對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力影響及小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理變化，初步探討HCMV感染導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙發(fā)生的可能時(shí)間，以期為HCMV感染與阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的病因?qū)W研究及發(fā)生機(jī)制提供新的依據(jù)。 方法：將HCMV ADl69株在人胚胎成纖維細(xì)胞(HF)細(xì)胞上增殖傳代，并經(jīng)

2、三次空斑技術(shù)純化后用作接種小鼠毒種；選用健康6-8周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠35只，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組，即病毒感染組，對(duì)照組設(shè)為兩組，即滅活病毒組和HF細(xì)胞對(duì)照組。病毒感染組小鼠15只，每只腹腔注射1.8×107pFU的HCMV懸液；滅活病毒組小鼠10只，每只腹腔注射經(jīng)56℃，30min滅活的1.8×107PFU的HCMV懸液；HF細(xì)胞對(duì)照組小鼠10只，每只腹腔注射1×105同株同代HF細(xì)胞懸液。以上三組小鼠在屏蔽系統(tǒng)中繼續(xù)飼養(yǎng)3個(gè)月(期

3、間密切觀察小鼠一般狀況和體重變化)后，通過自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠行為學(xué)有無改變；在確定實(shí)驗(yàn)組小鼠已出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能障礙的基礎(chǔ)上，引頸處死小鼠，取大腦皮質(zhì)組織進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)以確定HCMV感染狀態(tài)及大腦皮質(zhì)組織病理變化： (1)組織勻漿進(jìn)行病毒分離與鑒定； (2)PCR、RT-PCR分別檢測(cè)HCMV UL83、UL 54 DNA和相應(yīng)的mRNA；(3)間接免疫熒光檢測(cè)石蠟包埋切片中HCMV pp65

4、抗原的表達(dá)；(4)HE染色觀察大腦皮質(zhì)組織病理改變(5)戊二醛固定，超薄切片用于透射電鏡觀察大腦皮質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化和皰疹病毒樣顆粒。 結(jié)果： (1)小鼠一般狀況及體重檢測(cè)：病毒感染組中3只小鼠出現(xiàn)攝食、飲水減少，精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)減少，所設(shè)兩組對(duì)照組小鼠未見明顯異常；三組小鼠體重差異沒有顯著性(P>0.05)； (2)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果： ①自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：病毒感染組小鼠活動(dòng)次數(shù)較兩組對(duì)照組小

5、鼠少，但三組間差異沒有顯著性(P>0.05)。 ②Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果：A、定位航行實(shí)驗(yàn)：病毒感染組小鼠的平均逃避潛伏期較對(duì)照組長(zhǎng)，三組間的平均逃避潛伏期差異有顯著性(P<0.05)：組間兩兩比較，病毒感染組分別與HF細(xì)胞對(duì)照組、滅活病毒組之間差異有顯著性(均為P<0.05)，對(duì)照組之間差異無顯著性(P<0.05)。不同時(shí)間之間差異有顯著性(P<0.05)，從每天看，除第1天三組之間差異無顯著性(P>0.05)；第2、3天

6、病毒感染組與滅活病毒組之間差異有顯著性(均為P<0.05)，第4、5、6天三組之間差異均有顯著性(均為P<0.05)；B、空間搜索實(shí)驗(yàn)：以小鼠第一次穿過原平臺(tái)的時(shí)間和穿過原平臺(tái)次數(shù)為指標(biāo)，三組間差異均有顯著性(均為P<0.05)，且病毒感染組小鼠第一次穿過原平臺(tái)的時(shí)間明顯長(zhǎng)于HF細(xì)胞對(duì)照組和滅活病毒組(均為P<0.05)，而病毒感染組小鼠穿過原平臺(tái)次數(shù)明顯少于HF細(xì)胞對(duì)照組和滅活病毒組(均為P<0.05)：對(duì)照組之間差異均無顯著性(均為

7、P>0.05)。 ③跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)：學(xué)習(xí)期病毒感染組小鼠死亡1只，該組小鼠錯(cuò)誤次數(shù)較兩組對(duì)照組高，三組間差異有顯著性(P<0.05)，對(duì)照組間差異無顯著性(P>0.05)；記憶期三組小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)和潛伏期比較，差異均有顯著性(均為P<0.05)，對(duì)照組間差異均無顯著性(P>0.05)。 (3)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果： ①病毒感染組實(shí)驗(yàn)結(jié)果：15只中有11只小鼠大腦皮質(zhì)勻漿病毒分離后可見到典型的HCMV致CPE，并擴(kuò)增出HCMV

8、 UL 83 DNA及相應(yīng)mRNA，間接免疫熒光檢測(cè)到HCMVpp65抗原的表達(dá)：其中的3只小鼠大腦皮質(zhì)勻漿病毒分離為陰性，但PCR檢測(cè)大腦皮質(zhì)組織HCMV UL 83和UL 54基因?yàn)殛栃?，而RT-PCR及間接免疫熒光檢測(cè)均為陰性；死亡1只小鼠大腦皮質(zhì)未進(jìn)行病毒分離，但PCR檢測(cè)HCMVUL83和UL54基因陽性，RT-PCR檢測(cè)陰性； ②所設(shè)兩組對(duì)照組以上檢測(cè)結(jié)果均為陰性。 (4)病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果：HE染色發(fā)現(xiàn)病毒感染

9、組小鼠大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)出現(xiàn)明顯的病理變化，大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹，數(shù)目減少，細(xì)胞核淡染、濃縮、甚至消失：海馬區(qū)細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)疏松、突起變少，細(xì)胞出現(xiàn)空泡化，著色較對(duì)照組較淺，細(xì)胞層數(shù)減少；透射電鏡下觀察神經(jīng)元組織構(gòu)筑受到破壞，細(xì)胞器均有不同程度損傷，并發(fā)現(xiàn)典型的皰疹病毒樣顆粒及病毒包涵體；而所設(shè)兩組對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)明顯的病理改變。 結(jié)論：在建立的HCMv原發(fā)持續(xù)性感染小鼠模型上，通過觀察和實(shí)驗(yàn)得到以下結(jié)論：(一)實(shí)驗(yàn)組小鼠感染