脂質(zhì)體阿霉素對鼻咽癌細(xì)胞株和食管癌細(xì)胞株的熱化療作用研究.pdf

1、目的：阿霉素(doxorubicin，ADM)是臨床常用的葸環(huán)類抗腫瘤藥物，抗瘤譜廣，療效好，但是可引起嚴(yán)重的心臟毒性，表現(xiàn)為各種心律失常，累積量大時(shí)，可引起心肌損傷乃至心衰，是臨床應(yīng)用受到限制的主要原因之一。多年來人們一直在尋找降低阿霉素毒副作用的有效方法，現(xiàn)研究較多的是包裹了聚乙二醇的脂質(zhì)體阿霉素(pegylated liposomal doxorubicin，PLD)，其較游離阿霉素最大的優(yōu)勢是明顯降低了心臟毒性，近年來受到越來越

2、多的關(guān)注。許多實(shí)驗(yàn)研究表明脂質(zhì)體阿霉素療效優(yōu)于游離阿霉素，且能有效的抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。臨床研究上顯示脂質(zhì)體阿霉素單用或聯(lián)合化療、熱療和放療在卵巢癌、乳腺癌、肝癌、Kaposi’s肉瘤、軟組織肉瘤、頭頸部腫瘤、宮頸癌都具有較好的療效，且副反應(yīng)較輕，病人一般都能夠耐受。熱療是腫瘤治療的重要輔助手段之一，聯(lián)合熱療能明顯的提高療效，脂質(zhì)體阿霉素在聯(lián)合熱療上，在許多體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，聯(lián)合脂質(zhì)體阿霉素的熱化療優(yōu)于單獨(dú)熱療或單藥脂質(zhì)體阿霉素，

3、也優(yōu)于熱療聯(lián)合游離阿霉素治療，熱療增加阿霉素從脂質(zhì)體中釋放出來，兩者具有協(xié)同抗腫瘤作用。臨床研究PLD聯(lián)合熱療具有同樣的效應(yīng)．在難治性的惡性軟組織肉瘤、復(fù)發(fā)的或耐藥的卵巢癌、晚期乳腺癌和肝癌的治療上有較好的療效。在鼻咽癌的治療上，大量的研究表明，聯(lián)合阿霉素、順鉑和氟尿嘧啶的化療聯(lián)合放療能提高局控率、近期療效和遠(yuǎn)期療效，目前有研究表明脂質(zhì)體阿霉素在頭頸部腫瘤包括鼻咽癌具有較好的療效。在食管癌的治療上，阿霉素在食管癌的治療用的不多，體外研究

4、顯示食管癌細(xì)胞對阿霉素是敏感的，臨床研究顯示順鉑、氟尿嘧啶和阿霉素的聯(lián)合治療具有一定的療效，但毒副反應(yīng)較重，脂質(zhì)體阿霉素在食管癌的研究方面目前報(bào)道較少。在其熱療上鼻咽癌和食管癌均難以進(jìn)行體外加溫，國內(nèi)使用腔內(nèi)微波加溫后能使這兩個(gè)部位的腫瘤獲得熱療，而且熱療聯(lián)合的綜合治療能提高療效。 本實(shí)驗(yàn)課題通過體外研究阿霉素和脂質(zhì)體阿霉素對鼻咽癌細(xì)胞株和食管癌細(xì)胞株的抑制作用，比較阿霉素與脂質(zhì)體阿霉素對細(xì)胞株的體外殺傷作用；并通過熱化療研究，

5、比較同樣溫度下脂質(zhì)體阿霉素是否優(yōu)于阿霉素，以及不同溫度脂質(zhì)體阿霉素的對細(xì)胞的殺傷作用，初步探討熱化療的可行性，為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體內(nèi)研究和臨床研究提供依據(jù)。 方法： 1．以體外培養(yǎng)鼻咽癌細(xì)胞株HNE和食管癌細(xì)胞株EC9706為靶細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，以未加藥的細(xì)胞作為陰性對照，以不含細(xì)胞的RPMI-1640培養(yǎng)液為空白對照，培養(yǎng)2小時(shí)貼壁。再加入不同濃度ADM和PLD，濃度為5μg/ml、10 μg/ml、20 μg

6、/ml、40 μg/ml、80 μg/ml，藥物作用1小時(shí)后，用Hank’s液洗滌2次后加入等量RPMI-1640培養(yǎng)液再培養(yǎng)48小時(shí)。用WST-1法酶標(biāo)儀測得波長在440nm的各濃度的吸光度值(OD值)，計(jì)算出兩種藥物對細(xì)胞株的抑制率，再通過相應(yīng)濃度的抑制率，使用直線回歸方程計(jì)算得到ADM和PLD的半數(shù)抑制濃度(IC50)。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，取三次實(shí)驗(yàn)的平均值。 2．再使用所測得的IC50時(shí)的藥物濃度，采用恒溫水浴加溫法進(jìn)行熱化療

7、研究，每種細(xì)胞株分為9個(gè)組： 37℃、43℃、37℃+ADM、41℃+ADM、43℃+ADM、脂質(zhì)體阿霉素37℃+PLD、41℃+PLD、43℃十PLD，進(jìn)行化療1小時(shí)。再用Hank’s液洗滌2次后用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌1次，加入等量RPMI-1640培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)48小時(shí)，采用WST-1法在酶標(biāo)儀上測得波長在440nm的吸光度值，再計(jì)算得到不同組的殺傷毒指數(shù)(CI值)。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，取平均值。使用SP

8、SS軟件方差分析對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1．三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到阿霉素和脂質(zhì)體阿霉素對鼻咽癌細(xì)胞株HNE的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為11.673μg/ml、18.688μg/ml(含阿霉素的量為2.076 μg/ml)，對食管癌細(xì)胞株EC9706的IC50分別為19.064μg/ml、51.359μg／ml(含阿霉素的量為5.707μg/ml)。 2．在比較兩藥物對細(xì)胞株熱化療的殺傷作用，室溫為22℃

9、。鼻咽癌細(xì)胞株HNE在41℃、43℃、37℃+ADM、41℃+ADM、43℃+ADM、37℃+PLD、41℃+PLD、43℃+PLD的CI值分別為3 1.80％、38.97％、49.14％、59.08％、71.64％、49.31％、73.01％、77.01％，食管癌細(xì)胞株EC9706在41℃、43℃、37℃+ADM、41℃+ADM、43℃+ADM、37℃+PLD、41℃+PLD、43℃+PLD的CI值分別為25.25％、41.62％、4

10、9.29％、64.80％、71.89％、49.39％、76.39％、79.01％，各組間進(jìn)行完全隨機(jī)的方差分析，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)P>0.05，說明方差齊性，組間比較采用LSD法。對兩種細(xì)胞株，單純熱療組、ADM熱療組和PLD組對鼻咽癌細(xì)胞的殺傷作用43℃組、41℃組、37℃組呈遞增趨勢，P<0.05，組間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在PLD熱療組，細(xì)胞殺傷作用在41℃和43℃之間的差異P=0.85>0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相同溫度下，對

11、兩種細(xì)胞組的殺傷作用，在37℃條件下，ADM組和PLD組與單純加熱組比較均強(qiáng)于單純熱療組，P<0.05差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)ADM組與PLD組比較，P=0.984>0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在4l℃和43℃條件下，殺傷作用PLD組、ADM組、空白組呈遞增趨勢，P<0.05統(tǒng)計(jì)學(xué)具有顯著差異。 結(jié)論： 1．作用1小時(shí)阿霉素和脂質(zhì)體阿霉素對鼻咽癌細(xì)胞株HNE的IC50分別為11.673μg/ml、18.688 μg/

12、ml(含阿霉素2.076 μg/ml)； 2．作用1小時(shí)阿霉素和脂質(zhì)體阿霉素對食管癌細(xì)胞株EC9706的IC50分別為19.064μg/ml、51.359μg/ml(含阿霉素5.707μg/ml)： 3．在熱化療作用上，阿霉素和脂質(zhì)體阿霉素對鼻咽癌細(xì)胞和食管癌細(xì)胞較單純熱療具有更強(qiáng)的殺傷作用； 4．單純熱療和阿霉素?zé)峄煂煞N細(xì)胞殺傷作用為：43℃>4l℃>37℃； 5．脂質(zhì)體阿霉素在43℃與41℃加熱對