外源性生長激素與肝癌侵襲轉移關系及其相關信號轉導通路研究.pdf

1、肝癌是一種高消耗性疾病，患者通過機體組織的分解為肝癌的生長提供能量和底物。因此，肝癌患者大多存在異常代謝旺盛、營養(yǎng)不良等情況，晚期常發(fā)展成為惡病質。重組人生長激素（recombinant hunman growth hormone，rhGH）具有代謝調理和免疫調節(jié)作用，可以改變腫瘤患者的異常代謝狀態(tài)，增強機體抵抗力，從而達到改善腫瘤患者營養(yǎng)狀況的目的。但由于rhGH具有促細胞增殖的作用,因此rhGH應用于腫瘤患者的安全性一直受到質疑。使

2、用rhGH是否會促進腫瘤細胞的增殖和轉移以及相關信號轉導機制如何是臨床亟待解決的重要課題。 目的： 本課題以rhGH對高轉移潛能人肝癌細胞株MHCC-97H生物學行為的影響為切入點，研究rhGH體外對MHCC-97H肝癌細胞株生長、凋亡及侵襲轉移等行為的影響；并通過RNA干擾技術沉默胰島素樣生長因子1受體（insulin like growth factor-1 receptor，IGF1R），研究生長激素／胰島素樣生長

3、因子－1（growth hormone /insulin like growth factor-1，GH/IGF-1）軸被阻斷后rhGH對MHCC-97H肝癌細胞株生物學行為影響的變化；探索GH/IGF-1軸后續(xù)與肝癌細胞凋亡和侵襲轉移相關的信號轉導通路；并通過體內實驗探索rhGH對裸鼠肝癌成瘤原位肝癌移植瘤生長和侵襲轉移能力的影響。研究結果將為闡明rhGH是否能安全應用于肝癌患者臨床治療提供理論依據(jù)。 方法： 構建RN

4、A干擾IGF1R真核表達載體，以pGCsi-U6-Neo-GFP為空白質粒載體，以IGF1R為靶基因,按GenBank IGF1R基因核苷酸序列和TuschI設計原則,選擇5對2條互補的帶發(fā)夾結構的核苷酸序列,連接到pGCsi-U6-Neo-GFP空載體中。轉染模型細胞（293T），進行RT-PCR及Western-blot檢測，篩選出沉默效果最好的RNA干擾IGF1R真核表達載體。再轉染MHCC-97H肝癌細胞株，G418篩選并建立I

5、GF1R基因穩(wěn)定低表達的MHCC-97H肝癌細胞株。用無血清培養(yǎng)液誘導MHCC-97H肝癌細胞株凋亡，采用終濃度為25、50、100、500ug/L的rhGH完全培養(yǎng)液進行干預。觀察rhGH對MHCC-97H肝癌細胞株動態(tài)生長狀況的影響；流式細胞技術檢測rhGH對MHCC-97H肝癌細胞株凋亡及細胞周期的影響；通過體外粘附及侵襲實驗檢測rhGH對MHCC-97H肝癌細胞株體外粘附及侵襲能力的影響；Western-blot法檢測磷脂酰肌醇

6、-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI-3K)和整合素兩條信號通路中關鍵信號分子絲氨酸-蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，AKT）和局部粘著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）的表達與磷酸化水平的改變。建立裸鼠皮下和原位肝癌移植模型，研究IGF1R基因沉默前后裸鼠皮下移植瘤的成瘤能力，以及IGF1R沉默后rhGH對裸鼠肝癌移植瘤生長和轉移的影響。

7、 結果： 構建的RNA干擾IGF1R真核表達載體經(jīng)酶切和DNA測序證實與設計完全一致。成功篩選出IGF1R基因沉默的MHCC-97H肝癌細胞。經(jīng)RT-PCR及Western-blot檢測后發(fā)現(xiàn)IGF1R沉默效率分別為85.9％和80.21％。rhGH干預后IGF1R表達正常的MHCC-97H肝癌細胞生長曲線較對照組明顯升高。在濃度為25ug/L、50ug/L、100ug/L的 rhGH干預下IGF1R表達正常的MHCC-97H

8、肝癌細胞S期細胞百分數(shù)增加，PI指數(shù)升高，細胞凋亡降低，MHCC-97H肝癌細胞粘附于96孔板和穿過transwell小室的細胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)；但rhGH濃度升至500ug/L后MHCC-97H肝癌細胞的生長曲線反而下降，細胞凋亡增加、穿過transwell小室的細胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)。IGF1R基因沉默后MHCC-97H肝癌細胞的生長曲線顯著下降、粘附及穿過transwell小室的細胞數(shù)量顯著減少(P<0.05

9、)；再以rhGH干預后MHCC-97H肝癌細胞的生長曲線無明顯抬高、凋亡無顯著降低、粘附于96孔板及穿過transwell小室的細胞數(shù)量無顯著增加（P>0.05）。以Western-blot檢測信號分子AKT、FAK的蛋白表達和磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，rhGH作用后pATK和pFAK磷酸化顯著增加(P<0.05)，IGF1R沉默后再加用rhGH，除較高濃度外，其余各組pATK和pFAK表達無明顯增加（P>0.05）。體內研究發(fā)現(xiàn)rhGH注射可以

10、使荷瘤裸鼠體重明顯增加，肝癌移植瘤體積顯著增大，（P<0.05）。但MHCC-97H肝癌細胞在裸鼠體內的轉移并無顯著增加。IGF1R基因沉默后裸鼠皮下移植瘤的成瘤率、原位肝癌接種模型中的肝癌移植瘤的體積顯著減小，（P<0.05）。再加用rhGH后其對裸鼠肝癌移植瘤的體積增大無顯著促進作用，（P>0.05）。 結論： 濃度為25ug/L、50ug/L、100ug/L的 rhGH在體外可以促進MHCC-97H肝癌細胞株增殖、

11、抑制其凋亡、并對其體外粘附及侵襲能力具有顯著促進作用。但rhGH濃度升至500ug/L后MHCC-97H肝癌細胞增殖、侵襲能力反而降低，細胞凋亡增加。RNA干擾IGF1R真核表達載體能夠有效沉默MHCC-97H肝癌細胞株IGF1R基因表達。IGF1R基因沉默后rhGH對MHCC-97H肝癌細胞的促進生長、侵襲和轉移的作用減弱，抑制凋亡的能力下降。對AKT與FAK的研究表明，rhGH可能通過激活PI-3K和整合素信號轉導通路來分別抑制MH