中國櫻桃AP2-ERF轉(zhuǎn)錄因子在花芽休眠解除過程的表達(dá)與作用研究.pdf

1、中國櫻桃（Prunus pseudocerasus）是薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)李屬（Prunus）的落葉喬木果樹，因其果實(shí)味道鮮美，營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者的喜愛;又因其果實(shí)成熟期早，成為中國重要的經(jīng)濟(jì)栽培果樹之一。中國櫻桃與其它落葉果樹一樣，都存在典型的自然休眠現(xiàn)象，而花芽的休眠與休眠解除則與開花率、座果率有著復(fù)雜而密切的聯(lián)系，最終影響果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前認(rèn)為足夠的低溫積累是誘導(dǎo)中國櫻桃花芽休眠

2、解除的關(guān)鍵因素之一，低溫積累不足則會影響花芽休眠及休眠解除，因此開展低溫積累誘導(dǎo)花芽休眠解除分子機(jī)制有重要意義。
　　AP2/ERF是一類植物中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物的生長發(fā)育，具有響應(yīng)低溫等功能。本研究從‘短柄’櫻桃花芽轉(zhuǎn)錄組文庫(Genbank accession SRX695147)中篩選了具有完整ORF的AP2/ERF類基因，分析了其生物信息學(xué)特征;利用實(shí)時定量PCR技術(shù)(Real-time PCR)分析所有基因

3、在低溫誘導(dǎo)花芽休眠解除過程中的表達(dá)特性，篩選了一個與休眠解除相關(guān)基因的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，命名為PpcERF1，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將PpcERF1基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，研究了該基因?qū)D(zhuǎn)基因擬南芥生長發(fā)育的影響，更進(jìn)一步克隆并分析了該基因啟動子的表達(dá)特性。為深入研究擬南芥早花原因，采用RNA-seq技術(shù)對轉(zhuǎn)基因即將抽出花莖的擬南芥進(jìn)行分析。取得以下研究結(jié)果:
　　1、篩選得到21個含有完整ORF的Unigene序列被注釋為AP2/ER

4、F轉(zhuǎn)錄因子。氨基酸的脂肪指數(shù)、疏水性、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)等理化性質(zhì)和分布，結(jié)果表明:KT369533、KT369543、KT369544、KT369549和KT369553的理論等電點(diǎn)(pI)大于8，為堿性蛋白質(zhì);KT369535、KT369536、KT369538和KT369551的pI＜5，為酸性蛋白質(zhì);剩余的5＜pI＜8，為中性蛋白質(zhì)，說明這些基因可能在不同生理環(huán)境中參與不同信號傳導(dǎo)。不穩(wěn)定指數(shù)分析結(jié)果表明除KT369536、KT36

5、9537和KT369557三個氨基酸的不穩(wěn)定指數(shù)分別為35.14，37.39和39.27外，其余的不穩(wěn)定指數(shù)均大于40。氨基酸分子量之間分析表明它們之間存在較大差異，而原子組成、脂肪指數(shù)和總平均疏水性等性質(zhì)差異不大，總平均親水性均小于0，表明這些蛋白為親水蛋白。從蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測分布結(jié)果看，它們均分布在膜外，有利于下游基因表達(dá)的調(diào)控;二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)除KT369557之外，其余蛋白的無規(guī)則卷曲所占比例基本在50％左右，而KT369557

6、中以α-螺旋所占比例最大，達(dá)到42.77％。蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測KT369543雖然在細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，但主要分布在細(xì)胞質(zhì)中;KT369538只分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，KT369547分布在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞骨架上;KT369535與KT369539在細(xì)胞核、線粒體、細(xì)胞質(zhì)、過氧化物酶體和細(xì)胞骨架上均有分布，表明AP2/ERFs蛋白分布廣泛，在細(xì)胞中合成，大部分必須借助于核定位信號進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮調(diào)控作用。
　　2

7、、利用qRT-PCR技術(shù)分析了AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子編碼基因分別在不同時間低溫處理的花芽中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)21個基因中有15個基因受低溫誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)烈，其中KT369538(PpcERF1)最早被誘導(dǎo)，在櫻桃花芽低溫處理96h后上調(diào)2.31倍，隨后呈現(xiàn)逐步下調(diào)表達(dá)，推測該基因可能參與低溫誘導(dǎo)花芽休眠解除進(jìn)程。另有3個基因（KT369536，KT369537和KT369549）對低溫的響應(yīng)不明顯，有3個基因（KT369543，KT3695

8、44和KT369545）對低溫幾乎沒有響應(yīng)。
　　3、為進(jìn)一步探究PpcERF1基因的功能，對轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子萌發(fā)和開花特性進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)低溫處理的超表達(dá)和野生型擬南芥分別在培養(yǎng)箱培養(yǎng)36h，轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)率達(dá)到55.94％，而野生型種子的萌發(fā)率僅為27.77％，說明PpcERF1對擬南芥種子的萌發(fā)具有明顯促進(jìn)作用。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在8片可見葉片時就抽出莖，而野生型植株平均要在10片可見葉片方可觀察到此現(xiàn)象

9、，說明轉(zhuǎn)基因植株具有早花現(xiàn)象。推測該基因可能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥提前開花。為進(jìn)一步研究PpcERF1基因的表達(dá)特性，本研究克隆了該基因啟動子序列，分別采用低溫和ABA進(jìn)行處理，利用熒光素酶活性檢測實(shí)驗(yàn)進(jìn)行啟動子活性分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入PpcERF1基因啟動子是對照的1.72倍，經(jīng)過低溫處理4天后實(shí)驗(yàn)組是對照組的14.84倍，而經(jīng)過ABA處理的實(shí)驗(yàn)組是對照組的5.98倍，表明低溫和ABA均能誘導(dǎo)該啟動子表達(dá)，因此推測與休眠有關(guān)的因素可能通過該啟動子

10、進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)控。根據(jù)以上研究結(jié)果，認(rèn)為中國櫻桃AP2/ERFs轉(zhuǎn)錄因子可能參與了花芽休眠解除過程的調(diào)控。
　　4、為深入分析超表達(dá)植株出現(xiàn)上述促進(jìn)作用的可能原因，采用RNA-seq技術(shù)對轉(zhuǎn)基因植株和對照植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。分別得到約40M的clean reads，堿基數(shù)達(dá)到3.6G，其中映射到轉(zhuǎn)錄組文庫的總讀數(shù)25M左右，所占比例達(dá)到62.24％，用來后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析的唯一匹配讀數(shù)達(dá)到25M，占61.42％，轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量較好。從差異

11、基因表達(dá)數(shù)據(jù)中分析獲得上調(diào)表達(dá)基因627個，其中有11個基因上調(diào)倍數(shù)大于5，有66個基因上調(diào)倍數(shù)在2-5之間;獲得下調(diào)表達(dá)的基因364個，其中有3個基因的下調(diào)倍數(shù)小于-5，有40個基因的下調(diào)倍數(shù)在-2至-5之間。上調(diào)表達(dá)的基因大多與CYP、JA等相關(guān)，其中上調(diào)表達(dá)最明顯的基因是AT3G48520.1，即CYP94B3，已被證實(shí)該基因缺失會引起擬南芥晚花。經(jīng)熒光定量PCR驗(yàn)證與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相同，進(jìn)一步證明所得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。經(jīng)對擬南芥幼苗