Twist基因影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的研究.pdf

1、Twist基因在惡性腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)中發(fā)揮重要作用。在這項(xiàng)研究中，我們通過(guò)SW480、HCT116、HT29結(jié)腸癌細(xì)胞系和裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，研究Twist基因和EMT相關(guān)分子Vimentin和E-cadherin在體外和體內(nèi)的表達(dá)。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：Twist基因影響結(jié)腸癌細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移能力的體外實(shí)驗(yàn)。
　　 目的：

2、探討Twist基因在調(diào)控SW480、HCT116和HT29結(jié)腸癌細(xì)胞系發(fā)生EMT中的作用機(jī)制，進(jìn)而明確其對(duì)惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 方法：培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、HCT116和HT29，應(yīng)用Real time-PCR和Westernblot法檢測(cè)三種細(xì)胞系Twist分子的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。提取、純化并重組質(zhì)粒，包括表達(dá)Twist基因pTracer-CMV/BSD-Twist和空質(zhì)粒pTracer-CMV

3、/BSD，抑制Twist基因表達(dá)的pGenesil1.2-Twist-shRNA和空質(zhì)粒pGenesil1.2-shRNA。通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染至3個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系，每個(gè)細(xì)胞系分5組:(1)上調(diào)實(shí)驗(yàn)組:轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD-Twist(2)上調(diào)陰性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD;(3)下調(diào)實(shí)驗(yàn)組:轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGenesil1.2-Twist-shRNA;(4)下調(diào)陰性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pGenes

4、il1.2-shRNA;(5)空白對(duì)照組:未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，應(yīng)用Real time-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞Twist，E-cadherin和Vimentin分子mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平，采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力，使用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　 結(jié)果：⑴在三個(gè)人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、HCT116和HT29中， Twist分

5、子mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平由高到低依次為HCT116→SW480→HT29，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑵成功提取、純化和重組pTracer-CMV/BSD，pTracer-CMV/BSD-Twist，pGenesil1.2-shRNA和pGenesil1.2-Twist-shRNA質(zhì)粒。⑶將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3個(gè)細(xì)胞系48hrs后，倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白。⑷流式細(xì)胞儀檢測(cè)pTracer-CMV/BSD-Twist質(zhì)

6、粒轉(zhuǎn)染率在SW480、HCT116和HT29分別為21.6％、22.3％ and22.7％，pGenesil1.2-Twist-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率為21.2％、23.4％和30.3％。⑸pTracer-CMV/BSD-Twist質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞系，SW480、HCT116和HT29均較轉(zhuǎn)染前高表達(dá)Twist分子（P＜0.05)，Vimentin分子mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），而E-cadherin分子mRNA轉(zhuǎn)錄

7、及蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的各細(xì)胞系間比較其差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。相關(guān)性分析顯示，Twist與Vimentin的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（P＜0.01)，而與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。⑹pGenesil1.2-Twist-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480、HCT116和HT29后，HCT116細(xì)胞系Twist和Vimentin的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染前顯著降低（P＜0.05

8、)，E-cadherin分子轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染前后的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SW480和HT29細(xì)胞系在pGenesil1.2-Twist-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后各指標(biāo)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。相關(guān)性分析顯示，只有HCT116細(xì)胞系Twist和Vimentin的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)水平呈正相關(guān)（P＜0.01)。⑺重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)三種細(xì)胞系的增殖和活力沒(méi)有影響。8.pGenesil1.2-Twist-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)

9、染HCT116細(xì)胞系后其遷移和侵襲能力明顯受到抑制（P＜0.01）。
　　 結(jié)論：①在人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480， HCT116和HT29中，HCT116的Twist基因表達(dá)最高。②上調(diào)上述3個(gè)細(xì)胞系Twist基因表達(dá)，可以促使Vimentin分子高表達(dá)和E-cadherin分子低表達(dá)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)了EMT分子事件的發(fā)生。③干擾Twist基因可以有效地沉默HCT116細(xì)胞系Twist基因的表達(dá)，降低Vimentin的

10、表達(dá)，逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化，有效的抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲遷移。
　　 第二部分：Twist基因影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
　　 目的：研究Twist基因和EMT相關(guān)指標(biāo)在裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型中的表達(dá)。
　　 方法：使用重組質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD-Twist、pGenesi11.2-Twist-shRNA和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染SW480，HCT116和HT29，采用脾臟注射法建立裸鼠肝轉(zhuǎn)移模型

11、，注射30天后取肝臟和脾臟標(biāo)本，應(yīng)用Real time-PCR和免疫組化法檢測(cè)肝臟和脾臟Twist和Vimentin的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：成功建立裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，3個(gè)細(xì)胞系無(wú)論是否進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，其模型的肝臟組織Twist和Vimentin的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于脾臟（P＜0.05）。注射pTracer-CMV/BSD-Twist質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞系后，與注入未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系比較，肝臟和脾臟具有更高的Twist和

12、Vimentin分子mRNA轉(zhuǎn)錄水平（P＜0.05）。注射pGenesil1.2-Twist-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞系后，肝臟和脾臟Twist和Vimentin分子mRNA轉(zhuǎn)錄水平較注射質(zhì)粒pTracer-CMV/BSD-Twist均顯著降低（P＜0.05），但與注入未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系比較只有HCT116組出現(xiàn)Twist和Vimentin的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下降（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：在HCT116細(xì)胞系，RNA干擾Twi