豬葡萄球菌ExhB基因的原核表達及其感染裸鼠和Balb-c小鼠模型的研究.pdf

1、豬葡萄球菌(Staphylococcus hyicus,S.hylcus)是小豬全身性滲出性皮炎(Exudative epidermit，EE)的病原，隨著養(yǎng)殖集約化程度的增強和早期斷奶技術的采用，小豬全身性滲出性皮炎對養(yǎng)豬業(yè)所帶來的負面影響也將日益明顯。該病原的不同毒株可以產生不同的毒素，被命名為ExhA、ExhB、ExhC、ExhD四種，現(xiàn)已證實不同毒株產生的毒素是引起仔豬發(fā)病的主要因素。本文主要對可以產生B型毒素的豬葡萄球菌菌株進

2、行研究。本病的感染動物模型多選用SPF豬。鑒于小鼠在作為動物模型方面有著簡便，經濟，易于操作等明顯的優(yōu)勢，且該病在小鼠身上的研究國內外尚鮮見報道。因此，本研究選用裸鼠及Balb/c小鼠作為實驗動物；對分離鑒定的豬葡萄球菌ExhB基因進行克隆表達，對所表達蛋白的致病性進行鑒定。并將該分離菌經肌肉注射裸鼠和Balb/c小鼠，探討裸鼠和Balb/c小鼠對豬葡萄球菌的易感性及豬葡萄球菌對裸鼠和Balb/c小鼠的致病性。 根據GeneBa

3、nk中收錄的Staphylococcus hylcus ExhB基因(序列號：AF515454等)的核苷酸序列，設計一對特異性引物P1，P2。對已經過生化鑒定的豬葡萄球菌基因組進行PCR擴增，獲得大小為1280bp的基因片段，將其克隆到pMD18-T載體，獲得重組質粒pMD-ExhB。 用帶有Kpn I、HindⅢ酶切位點的引物P1’，P2'，以重組質粒pMD-ExhB為模板，擴增去掉N端疏水性AA的ExhB基因。用相同的限制性

4、內切酶酶切該PCR產物和表達載體pET-32a.后構建重組表達載體pET—ExhB，轉化宿主菌BL21(DE3)，經酶切及PCR鑒定篩選出陽性克隆，測序證明目的基因以正確的閱讀框插入了表達載體，用不同濃度的IPTG誘導表達ExhB蛋白主要抗原區(qū)基因，收集菌液進行SDS-PAGE電泳，原核表達產物大小約為45Ku。通過ELISA和瓊脂擴散實驗表明，所表達的包涵體蛋白可以與用菌體制得的多克隆抗血清發(fā)生特異性結合；用復性蛋白在裸鼠身上攻毒后可

5、以產生皮炎病變。 用分離鑒定的豬葡萄球菌菌體、上清以及二者的混合物經肌肉注射裸鼠和Balb/c小鼠，通過眼觀、剖檢和做病理組織學切片確定其感染的狀況，結果發(fā)現(xiàn)裸鼠和Balb/c小鼠均可被感染，分別產生不同程度的相似的臨床癥狀。裸鼠在感染后的二到三天背部和面部皮膚上開始出現(xiàn)大量小的紅色囊泡，四到五天后部分囊泡消失，部分形成結痂。一些裸鼠眼睛還會有較多的膿性分泌物滲出.感染兩周后相繼死亡。Balb/c小鼠感染該菌后多表現(xiàn)急性臨床癥狀

6、，感染后二到三天就相繼死亡，因此表現(xiàn)不出明顯的眼觀病變。 只有很少一部分小鼠皮膚上會出現(xiàn)炎性滲出，導致該處皮膚脫落。剖檢發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟明顯腫大，肝臟充血明顯。病理切片發(fā)現(xiàn)感染小鼠表皮角質脫落明顯，棘細胞層增生，稱為“棘皮癥”，這是豬感染該菌后所產生的特征性癥狀。心、肝、肺等組織部位的細胞也都有不同稱度的腫脹、變性、壞死。研究表明，Balb/c小鼠比裸鼠對豬葡萄球菌更易感，裸鼠感染后有清晰的肉眼可見的臨床癥狀產生，而Balb/c小鼠