硫化氫在SB203580影響肝星狀細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：
　　探討硫化氫（H2S）、SB203580對大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC)增殖、凋亡的影響，研究P38MAPK信號通路在H2S影響大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC)增殖、凋亡中的作用，探討H2S是否通過P38MAPK信號通路起到抗肝纖維化作用。
　　方法：
　　(1) HSC-T6細(xì)胞的培養(yǎng)：以10％胎牛血清DMEM(高糖)培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種后6-8h細(xì)胞貼壁，24h-48h換液，72h增殖達(dá)生長面積90%消化傳代，細(xì)胞傳代周期

2、穩(wěn)定用于實驗。(2) MTT法檢測HSC-T6細(xì)胞的增殖：分對照組與實驗組，實驗組按照加藥濃度梯度分組：NaHS組分別按照25 umol/L、50 umol/L、75 umol/L、100μmol/L、200μmol/L濃度梯度給藥，SB203580組分別按照10 umol/L、25 umol/L、50 umol/L、75umol/L、100umol/L的濃度梯度給藥，均干預(yù)48h，加入MTT20μl暗處反應(yīng)4h，加入DMSO150μl

3、終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀于570nm波長處檢測各孔吸光度（A）值。（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測H2S與SB203580對HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響：分5組，正常對照組、DMSO組、NaHS50μmol/L組、SB20358075μmol/L組(SB組)、SB20358075umol/L+NaHS50umol/L組(SB+NaHS組)，采用流式細(xì)胞儀經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染檢測各組細(xì)胞HSC-T6細(xì)胞的凋亡率；同等實驗條件，Hoech

4、st33342染色，倒置熒光顯微鏡下觀察并計算HSC-T6細(xì)胞的凋亡率。（4）逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測HSC-T6細(xì)胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)：實驗分對照組、DMSO組、NaHS組、SB組、SB+NaHS組，提取HSC-T6細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測細(xì)胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)。（5）Western blot法檢測HSC-T6細(xì)胞中P-P38、Caspase-3蛋白的表達(dá)：實驗分對照組、DMSO組、NaHS組、SB組、SB+N

5、aHS組，Western blot法檢測細(xì)胞中P-P38、Caspase-3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?。?）HSC生長良好，總體死亡率<5%，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，可見NaHS組細(xì)胞密度增大，SB組細(xì)胞增殖不明顯，可見凋亡細(xì)胞。（2）按實驗組干預(yù)HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)48h后，與對照組相比，低濃度NaHS（25umol/L、50umol/L、75umol/L）促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞增殖，NaHS50umol/L促細(xì)胞增殖

6、顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SB203580抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。（3）低濃度NaHS對細(xì)胞凋亡無影響，SB203580可顯著誘導(dǎo)HSC細(xì)胞凋亡，與NaHS聯(lián)合促細(xì)胞凋亡增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。（4）NaHS使HSC-T6細(xì)胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)增強，SB203580促使HSC-T6細(xì)胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)含量減少，二者聯(lián)合使細(xì)胞中Ⅰ、Ⅲ型膠原

7、 mRNA表達(dá)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。（5）NaHS使HSC-T6細(xì)胞中P-P38、Caspase-3蛋白表達(dá)增強，二者聯(lián)合P-P38蛋白表達(dá)減少、Caspase-3蛋白表達(dá)增強。
　　結(jié)論：
　　（1） H2S通過激活P38MAPK信號通路促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖。（2） P38MAPK信號通路被阻斷后通過調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而延緩肝纖維化的發(fā)展。（3） H2S在P38MAPK信號通路被抑制后使刺激的